Zell-Sorter
Final Report Abstract
Der Zell-Sorter wurde und wird am Lehrstuhl für Mikrobiologie zur Beantwortung einer Vielzahl infektionsund zellbiologischer Fragestellungen benutzt. Instrumental war dabei die Aufstellung des Geräts in einem für Arbeiten mit pathogenen Organismen zugelassenen Bereich, sowie die konsequente Anwendung arbeitschutztechnischer Vorkehrungen, die ein kontaminations- und expositionsfreies Arbeiten mit dem Zell- Sorter ermöglichten. Zu den Arbeiten zählten unter anderem das Screening von shRNA-basierten lentiviralen Bibliotheken, welche ungefähr 60.000 menschliche Gene durch RNAi auf mRNA- und damit auch auf Proteinebene depletieren können. Diese Hochdurchsatzscreens wurden bisher zur Identifizierung von Internalisierungsmechanismen von mehreren Bakterienarten durch Epithelzellen sowie zur Identifizierung von Wirtszellsignalwegen bei der Initialisierung des Zelltods durch intrazelluläre Pathogene eingesetzt. Weiterhin erlaubte das performante Gerät das Sortieren von Wirtszellen, welche mit hochkomplexen Pools bakterieller Transposonmutanten infiziert wurden, was letztlich zur Identifizierung eines neuen Virulenzregulators führte. Zudem konnten Messung des phagosomalen Ausbruchs von Staphylococcus aureus durch reversible Fluoreszenzlöschung von Fluorescein in den angesäuerten Phagosomen in Epithel, Endothelzellen sowie Macrophagen etabliert werden. Dies führte zur Identifikation der dabei beteiligten Virulenzfaktoren. Das Gerät erwies sich zudem als instrumental zur Erstellung von Einzelzellklonen bei shRNA-basierten Knockdowns und CRISPR/CAS-basierten Knockouts von Genen in Säugerzellen, welche nun erlauben, funktionelle Studien über die Beteiligung von Wirtszellfaktoren anzufertigen bei i) der Etablierung von intrazellulären Infektionen, ii) der Manipulation des Wirtszelltods durch internalisierte Pathogene, iii) bei dem phagosomalen Ausbruch von Pathogenen, etc. Darüber hinaus wurde der Zell-Sorter genutzt, um primäre adulte Stammzellen (von Maus und Mensch) zu isolieren und funktionell zu analysieren. Um das methodische Spektrum des Geräts zu erweitern, rüstete der Lehrstuhl für Mikrobiologie kürzlich den Zell-Sorter mit einem weiteren Laser nach, um durch die neue Konfiguration das Analysespektrum auf Untersuchungen zur Manipulation des Zellzyklus durch pathogene Organismen zu erweitern und um ratiometrische Messungen zu erlauben.
Publications
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