Entwicklung neuer Anwendungsmöglichkeiten ortsspezifischer Rekombinasen im Zebrafisch

• Antragsteller: Professor Dr. Michael Brand
• Fachliche Zuordnung: Entwicklungsbiologie
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 202056782

In Säugetieren stellt die Cre-vermittelte, ortsspezifische Rekombination eine unverzichtbare Technologie dar, die eine zielgerichtete Veränderung des Genoms erlaubt und somit Zellschicksals- oder Misexpressionsstudien und Analysen von konditionellen Mutationen ermöglicht. Vor kurzem zeigten wir, dass Cre und seine induzierbare Variante CreERT2 ebenfalls höchst effektiv im Modellorganismus Zebrafisch verwendet werden kann. Um den geringen Bestand verfügbarer CreERT2-Treiberlinien signifikant zu erhöhen, benutzten wir während der ersten Förderperiode die Genfallentechnologie (gene trap) um neue transgene Zebrafische herzustellen. Von 148 identifizierten Insertionen wurden 42 ausgewählt, als stabile Linien etabliert und detailliert charakterisiert in Bezug auf Integration, Expressionsprofil, Funktionsfähigkeit und mögliche Phänotypen. Alle gewonnen Daten wurden zusammengefasst in einer open access-Datenbank - the zebrafish CreZoo (http://crezoo.crt-dresden.de) - die erste Datenbank, die verfügbare Cre-Treiberlinien für die Forscher des Modellorganismus Zebrafisch erfasst. In einem anderen Ansatz um konditionelle Mutationen auch im Zebrafisch möglich zu machen, zeigten wir die Funktionalität unseres Vektors basierend auf der flip-excision Technologie (FlEx), der nun einsatzbereit ist. In der zweiten Förderperiode beabsichtigen wir, unseren erfolgreichen Ansatz fortzuführen und 100 weitere transgene Zebrafische herzustellen, die CreERT2 in unterschiedlichen Geweben des sich entwickelnden und adulten Zebrafisch exprimieren. Darüber hinaus ist es durch den technischen Fortschritt nun möglich, zielgerichtete Veränderungen im Genom des Zebrafischs (mittels TALEN oder CRISPR/Cas) vorzunehmen, welche weiterführende Anwendungen der Cre-vermittelten, ortsspezifischen Rekombination im Zebrafisch erlauben. Wir werden durch die Homologie-vermittelte Reparatur im Anschluss eines CRISPR/Cas erzeugten Doppelstrangbruchs eine attP Zielsequenz in den ubiquitin b Locus einführen, so dass anschließend diese transgene Linie für die schnelle und einfache Herstellung von Cre-Effektorlinien genutzt werden kann. Des Weiteren werden wir unter Ausnutzung von CRISPR/Cas erzeugten Doppelstrangbrüchen ein CreERT2 knock-in Allel im elavl3 Locus bzw. ein konditionelles gata3 Allel herstellen. Unsere Ergebnisse werden die Anwendungsmöglichkeiten der Cre-vermittelten, ortsspezifischen Rekombination im Zebrafisch signifikant erhöhen und die erzeugten neuen transgenen Linien werden wertvoll für alle Forscher des Modellorganismus Zebrafisch sein.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Beteiligte Person: Dr. Stefan Hans