Nitrit-abhängige NO-Bioaktivität in der Zirkulation: Rolle von Hämoglobin, Carboanhydase und NO-Synthase
Zusammenfassung der Projektergebnisse
(1) Weder Erythrozyten noch Thrombozyten verfügen über funktionelle NOS. Mangelhafte analytische Methoden ist die wahrscheinlichste Erklärung für Berichte über Existenz und Funktionalität von NOS in Erythrozyten und Thrombozyten des Menschen. (2) Physiologisches Nitrit ist gleichmäßig zwischen Plasma und Erythrozyten im Blut von gesunden Probanden verteilt. Exogenes Nitrit akkumuliert im Plasma. (3) Am Nitrit-Transport sind CA in der Niere beteiligt. In Erythrozyten ist dies unklar. (4) In Erythrozyten wird Nitrit zu Nitrat oxidiert. Weitere Reaktionsprodukte sind Methämoglobin, HbSSG und HbSNO. HbSNO ist wahrscheinlich der Träger der Nitritabhängigen NO-Bioaktivität in der Zirkulation. Thiole spielen eine wesentliche Rolle bei Reduktion von Methämoglobin und HbSSG zu Hämoglobin. Thiole sind auch in der Lage, eine Nitrit-induzierte Bildung von Methämoglobin unter bestimmten Bedingungen zu unterbinden. Insbesondere NACET könnte ein effektives Antidot bei Nitrit/Nitratinduzierter Methämoglobinämie sein. (5) Nitrit reagiert mit CO2. Erythrozytäre CA beeinflussen diese Reaktion. Die Nitrit/CO2/CA-Reaktion führt nicht zur Bildung von NO, sondern zur Bildung von HONO. In Gegenwart von GSH bildet sich GSNO. In Gegenwart von Cystein bildet sich NO wahrscheinlich über die Bildung des extrem labilen S-Nitrosocystein. Ein Nitrit/CO2/CA/cGMP-Signalweg ist möglich in Thrombozyten und anderen, lösliche Guanylyl-Cyclase exprimierenden Zellen. Die Bedeutung des Nitrit/CO2/CA/cGMP-Signalweges in der Zirkulation bleibt noch zu untersuchen. (6a) Nitrit führt nicht zur „NOS-Entkopplung“. Die Bildung von Nitrat aus L-Arginin und NOS geht auf die Oxidation von NO durch NOS selbst zurück. Thiole hemmen die NOS-katalysierte Oxidation von NO zu Nitrat. Der in der Literatur allgemein akzeptierter Effekt der „NOS-Entkopplung“ ist wahrscheinlich keine Entkopplung in biochemischem Sinne, sondern eine Verminderung der NO-Bioverfügbarkeit durch NOS selbst, bevor NO das aktive Zentrum der NOS verlässt. Entsprechende, in der Literatur beschriebene Effekte von Thiolen und Tetrahydrobiopterin auf die „entkoppelten“ NOS gehen wahrscheinlich auf eine Inhibition der „suizidalen“ Oxidation von NO durch NOS. (6b) Oxidiertes Glutathion (GSSG) „entkoppelt“ nicht die NOS. GSSG hemmt die NOS-Aktivität erst bei pathologisch irrelevant hohen Konzentrationen. Solch hohe GSSG- Konzentrationen können nur dann entstehen, wenn das gesamte intrazelluläre GSH in GSSG oxidiert worden ist. 7) Massenspektrometrische Methoden (GC-MS, LC-MS/MS, IRMS) und der Einsatz von stabilen Isotopen sind unerlässlich in der NO-Forschung. Sie geben definitive, eineindeutige Antworten auf wissenschaftliche Fragen in der experimentellen und klinischen Forschung des NO-Stoffwechselweges. Die größte Überraschung im Rahmen des Projektes war die CA-katalysierte Bildung von GSNO aus Nitrit und GSH. Diese neue Nitrit-abhängige Aktivität der großen und ubiquitären Familie der CA ist wahrscheinlich von großer Bedeutung in viele Zellen und Gewebe, da auch Nitrit und GSH in biologischen Systemen ubiquitär sind. GSNO entfaltet viele NO-ähnliche Aktivitäten über verschiedene Mechanismen. Dass CA nicht nur die Reabsorption von Nitrit, einem NO-Reservoir, in der Niere regulieren, sondern auch Nitrit in bioaktives GSNO umwandeln können, sind zwei unerwartete aber sehr wichtige Erkenntnisse des vorliegenden Projektes. CA könnten somit viele wichtige, bislang unerkannte Nitrit-abhängige biologische Funktionen haben, jenseits der bekannten Regulation der Atmung und Pufferung des Blutes. Störung des CA-regulierten Nitrit/NO-Kreislaufs durch Krankheit, Ernährung und anderen Faktoren könnte zu NO-abhängigen Dysfunktionen in verschieden Zellen und Organen führen. Aufgrund der starken nitros(yl)ierenden Wirkung der salpetrigen Säure (HONO) könnte eine übermäßige Nitritabhängige Aktivität von CA auch zu Krankheiten wie Krebs führen. Die Nitrit-abhängige Aktivität von CA und ihre Bedeutung sind in zukünftigen Studien zu untersuchen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Doubts concerning functional endothelial nitric oxide synthase in human erythrocytes. Blood. 2012;119(5):1322-3
Böhmer A, Beckmann B, Sandmann J, Tsikas D
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Renal carbonic anhydrases are involved in the reabsorption of endogenous nitrite. Nitric Oxide. 2012;26(2):126-31
Chobanyan-Jürgens K, Schwarz A, Böhmer A, Beckmann B, Gutzki FM, Michaelsen JT, Stichtenoth DO, Tsikas D
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[Ureido-¹⁵N]citrulline UPLC-MS/MS nitric oxide synthase (NOS) activity assay: development, validation, and applications to assess NOS uncoupling and human platelets NOS activity. J Chromatogr B 2014;965:173-82
Böhmer A, Gambaryan S, Flentje M, Jordan J, Tsikas D
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Human blood platelets lack nitric oxide synthase activity. Platelets 2014;1–6
Böhmer A, Gambaryan S, Tsikas D
