Einfluss der Podozyten auf die Regulation der glomerulären Filtrationsrate eines einzelnen Nephrons
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Während meines Aufenthalts im Labor von Prof. Janos Peti-Peterdi an der University of Southern California in Los Angeles wandte ich die im Rattenmodel etablierte in vivo Multiphotonenmikroskopie an Mäusen an. Wir fanden die besten Bildgebungsmöglichkeiten mit einer hohen Anzahl an oberflächlichen Nierenkörperchen im weit verbreiteten Mausstamm C57BL6 im Alter von 4 Wochen. Ein Projektteil war die Untersuchung von Veränderungen der Calciumspiegel im Podozyten und dessen Einfluss auf Podozytenkontraktionen. Hierzu experimentierten wir mit verschiedenen Möglichkeiten Calciumindikatoren in Podozyten zu laden. Durch die Kanüllierung der Aorta von unterhalb der Nierenarterie und das Abklemmen der Aorta oberhalb der Nierenarterie gelang es uns die Calciumindikatoren in einer plasmafreien Umgebung zu applizieren ohne den Blutfluß nach der Injektionsphase zu beeinträchtigen. Leider gelang es uns auf diese Weise nur Endothelzellen zu markieren, in Podozyten erreichten wir keine ausreichende Farbstoffkonzentration um die niedrigen Calciumspiegel in gesunden Podozyten zu visualisieren. Um dieses Problem zu lösen entschieden wir uns eine transgene Mauslinie mit einer podozytenspezifischen Expression des genetisch kodierten Calciumindikators GCaMP3 zu erzeugen. Es gelang uns zu zeigen, dass nach der Verletzung eines einzelnen Podozyten eine ausgeprägte Calciumwelle über das gesamte Nierenkörperchen fortgeleitet wird. Dies zeigt zum ersten Mal, dass Podozyten mit einer Erhöhung des intrazellulären Calciums auf eine Verletzung reagieren und dass Podozyten als funktionelles Synzytium verbunden sind. Wir führten Versuche mit verschiedenen Farbstoffen durch um eine spezifische Markierung der Podozyten anstelle der bisher benützten negativen Markierungstechnik zu erzielen. Die Injektion von BCECF, einem pH-sensitiven Farbstoff, ergab eine reproduzierbare kräftige Fluoreszenz in Podozyten. Aber weil BCECF gleichzeitig Endothelzellen markiert, generierten wir die Pod-GFP Maus, hier exprimieren Podozyten ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle des Podocin Promoters. Um die Folgen einer Verletzung des Podozyten in vivo zu untersuchen injizierten wir Adriamycin in Mäuse, aufgrund ausgeprägter systemischer Nebeneffekte entschieden wir uns jedoch ein Pod-GFP/ NEP25 Mausmodell zu erzeugen, bei dem mit GFP markierte Podozyten durch ein Immunotoxin spezifisch geschädigt werden können. Wir konnten zeigen, dass Podozyten während der daraus resultierenden Proteinurie Albumin aufnehmen. Als weiteres Modell der Nierenschädigung benützten wir die einseitige Harnleiterligation (UUO) in der Pod-GFP Maus. Überraschenderweise konnten wir zeigen, dass Podozyten 2 Wochen nach UUO anfingen sich zu teilen und Fortsätze in den proximalen Tubulus und in Richtung der parietalen Epithelzellen (PEC) zu bilden. Diese Fortsätze entsprangen von Podozyten der viszeralen Zellschicht und infiltrierten durch die PEC Schicht hindurch um die Basalmembran der Bowmanschen Kapsel als Leitstruktur für weiteres Wachstum zu verwenden. Nach lange bestehender UUO kann die parietale Zellschicht vollständig durch parietale Podozyten ersetzt werden, wir konnten jedoch keine Hinweise dafür finden, dass diese parietalen Podozyten Filtration in den interstitiellen Raum ermöglichen. Wir etablierten die Technik der mehrfachen Bildgebung am selben Tier um dasselbe Nierenkörperchen mehrfach im Abstand von 24 Stunden betrachten zu können. Hierbei zeigte sich eine dynamische Regulation der Podozytenfortsätze durch Voranschreiten, Rückzug und Abscheren der Fortsätze. Um die Fortsätze eindeutiger der Ursprungszelle zuordnen zu können generierten wir das Pod-Confetti Mausmodell, bei dem jeder Podozyt eines von vier verschiedenen Fluoreszenzproteinen exprimiert. Auch bei diesen Tieren führten wir eine UUO durch und sahen eine vergleichbare Formation von Fortsätzen wie in der Pod-GFP Maus. Außerdem konnten wir zeigen, dass neue Zellen in der gleichen Farbe, wie die Ursprungszellen an benachbarten Kapillarschlingen, in der parietalen Schicht erschienen, was unsere Theorie der proliferierenden Podozyten untermauerte. Schließlich verwendeten wir das PEPCK-GFP Mausmodell in dem wir eine GFP Expression in Parietalzellen und gelegentlich in Podozyten nachweisen konnten, dies ist mit der Theorie des Ersatzes von Podozyten durch PEC vereinbar. Erstmals gelang uns der Nachweis von Nanotubuli, sehr dünnen länglichen Strukturen, die Podozyten und PECs verbinden. Die Erkenntnis, dass sich Podozyten in Folge einer einseitigen Harnleiterligation teilen und in andere Regionen um das Nierenkörperchen wandern können, lässt vermuten, dass dies durch ein genetisches Programm gesteuert wird, welches die Reparatur und den Ersatz von Podozyten in anderen Krankheitsbildern unterstützen könnte.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. (2012) 302(2):F227-33
Peti-Peterdi J, Burford JL, Hackl MJ
