Untersuchungen zur funktionellen Kopplung von Dihydropyridin-Rezeptor (DHPR) und Ryanodin-Rezeptor (RyR) im Skelettmuskel

• Antragsteller: Professor Dr. Symeon Papadopoulos
• Fachliche Zuordnung: Anatomie und Physiologie
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 191988749

• Erstellungsjahr: 2016

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Der Skelettmuskel besitzt einen einzigartigen Mechanismus zur Übersetzung des elektrischen Signals (Depolarisation) in eine mechanische Antwort (Kontraktion). Das Schlüsselereignis dabei, die Aktivierung der Kalziumausschüttung durch den Ryanodinrezeptor (RyR1) nach dessen Aktivierung über den Dihydropyridinrezeptor (DHPR), ist in seinem molekularen Mechanismus weitgehend unverstanden. Insbesondere steht ein definitiver Nachweis der postulierten direkten mechanischen Kopplung von DHPR und RyR1 aus. Mithilfe der DFG-Sachbeihilfe und unter Einsatz der sensitiven FRET-Technik sollte in einem ersten Projektteil untersucht werden, ob und in welchem Ausmaß sich die räumliche Anordnung zytoplasmatischer DHPR-Domänen in Abhängigkeit vom RyR1 ändern. Mittels Doppeltmarkierung mit fluoreszierenden Proteinen konnten wir innerhalb intakter Muskelzellen tatsächlich zeigen, dass die Anwesenheit von RyR1 zu signifikanten Umlagerungen innerhalb des zytoplasmatischen DHPR-Interface führt. In einem zweiten Projektteil sollte die zelluläre Zielsteuerung der Komponenten der skelettmuskulären elektromechanischen Kopplung untersucht werden, insbesondere die Entstehung der charakteristischen DHPR-Tetradenstruktur. Hier konnten wir mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie, wieder in Kombination mit FRET, zunächst einen Schlüsselmechanismus identifizieren, mittels dessen die beta-Untereinheit des DHPR dessen zellulären Transport zu den sog. junctions ermöglicht. In zwei Erweiterungen der Fragestellung konnten wir mittels Genexpressionsanalyse auch zeigen, dass (a) die Abwesenheit von RyR1 während der Myogenese mit der zeitlich abgestimmten Expression wichtiger regulatorischer Proteine interferiert, womit die starken Beeinträchtigungen der Muskeldifferenzierung bei Abwesenheit von RyR1 nun teilweise erklärbar sind. Schließlich konnten wir mittels Fluoreszenzmikroskopie in Kombination mit Elektrophysiologie erstmalig zeigen, dass (b) die zytoplasmatische Domäne des RyR1 wichtige Funktionen des kompletten Kanals rekapituliert, wie z.B. die Zielsteuerung zu den junctions und, erstaunlicherweise, auch die Aktivierung von L-Typ Kalziumströmen durch den DHPR (sog. retrograde signaling). Das molekulare Verständnis der elektromechanischen Kopplung im Skelettmuskel wird dazu beitragen, die pathophysiologischen Vorgänge bei muskulären Erkrankungen, wie z.B. (kongenitalen) Myopathien aufgrund von RyR1-Mutationen, besser zu verstehen und in Richtung der Entwicklung therapeutischer Ansätze weiterzuarbeiten.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• (2012) Expression of concatemers of the DHPR 1S subunit to investigate the function of tetrads in skeletal muscle. 1st European Calcium Channel Conference 16th to 19th of May 2012, Alpbach, Austria
  Nina F. Linde, Anna Walter, Alexander Polster, Joshua Ohrtman, Kurt G. Beam, Symeon Papadopoulos
  
• (2012) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Indicates that Association with the Type I Ryanodine Receptor (RyR1) Causes Reorientation of Multiple Cytoplasmic Domains of the Dihydropyridine Receptor (DHPR) α1S Subunit. J Biol Chem. 283:29301-11
  Polster A, Ohrtman JD, Beam KG, Papadopoulos S
  
• (2012) Fret Reveals Substantial Reorientation of the Cytoplasmic Interface of the Skeletal Muscle Dhpr in the Presence of Ryr1. Biophysical Society 56th Annual Meeting, San Diego, California, February 25-29, 2012
  Polster A, Ohrtman JD, Beam KG & Papadopoulos S
  
• (2013)The Cytoplasmic Foot of Ryr1 without the Membrane Spanning Domain Targets Junctionally and Retrogradely Enhances Dhpr L-Type Ca2+ Currents. Biophysical Society 57th Annual Meeting, Philadelphia, Pennsylvania, February 4-6, 2013
  Alexander Polster, Joshua D. Ohrtman, Kurt G. Beam, Symeon Papadopoulos
  
• (2014) Expression of Covalently Linked Dhpr Cav1.1 Subunit Multimers to Investigate the Tetradic Arrangement of Dhprs in Skeletal Muscle. Biophysical Society 58th Annual Meeting, San Francisco, California, February 15-19, 2014
  Alexander Polster, Nina F. Linde, Kurt G. Beam, Symeon Papadopoulos
  
• (2016) Calcium Imaging in Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Myocytes. Methods Mol Biol. 1353:131-46
  Walter A, Šarić T, Hescheler J, Papadopoulos S