Kommunikation zwischen dem epiphytisch-lebenden, nicht-pathogenen Venturia inaequalis-Antagonisten Pseudomonas fluorescens Bk3 und der Wirtspflanze Malus domestica
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Bei der Untersuchung des nicht-pathogenen antagonistischen Bakterium Pseudomonas fluorescens Bk3 hinsichtlich der Anpassung an wechselnde Umweltbedingungen, wurde festgestellt, dass die Bakterien in ihrer Vermehrung durch eine extreme Lichteinstrahlung stark gehemmt werden, wobei diese Hemmung bereits durch eine leichte Abschattung aufgehoben werden konnte. Bei der Analyse der molekularbiologischen Prozesse zur Etablierung auf Pflanzenoberflächen mittels Suppressions-Subtraktions-Hybridisierung wurden hauptsächlich Sequenzen mit Homologien zu ribosomaler RNA ermittelt. Die hier angewendete modifizierte Methode für Prokaryonten bedarf daher einer weiteren Optimierung, um vollständig etabliert zu werden. Bereits im Vorfeld konnte eine extrazellulare Esterase aus P.fluorescens Bk3 durch einen Aktivitäts-Test nachgewiesen werden, der häufig für den Nachweis von Cutinasen eingesetzt wird. Darauf basierend wurde die Hypothese aufgestellt, dass es sich auch bei diesem Enzym um eine Cutinase handeln könnte, welche die Cuticula hydrolysieren kann, wobei die freigesetzten Monomere als mögliche Elicitoren zur Induktion von Pflanzenantworten dienen. Zur Klärung der Frage der Natur einer extrazellulären Cutinaseaktivität wurde zunächst mit dem artifiziellen Substrat p-Nitrophenylbutyral und anhand einer Esteraseaktivität dieses Protein über mehrere Schritte bis zur Homogenität aufgereinigt. Dabei stellte sich heraus, dass die hydrolytische Esterase-Aktivität Bestandteil eines hochmolekularen Proteinkomplexes von mehr als 2MDa ist und wahrscheinlich aus drei Proteinuntereinheiten von 47 kDa, 29 kDa und 17 kDa besteht. Durch ESI Q-ToF MS de novo Sequenzierung und nachfolgende Homologiesuche gelang es, die drei Proteinuntereinheiten als Flagellin (47 kDa, FliC), und zwei Outer Membrane Proteine (OprG, 29 kDa und OmpW, 17kDa) zu identifizieren. Die anschließende Charakterisierung des Proteinkomplexes ergab, dass dieser durch das nicht-ionische Detergenz ß-Dodecylmaltosid in verschiedene Substrukturen dissoziiert werden kann. Damit einhergehend ist ein Verlust der enzymatischen Aktivität zu beobachten, wobei letztere mit der Flagellin Untereinheit assoziiert ist. Ob dies eine Besonderheit von antagonistischen Bakterien oder eine generelle Erkenntnis ist, bedarf noch weiterer Untersuchungen. Die Applikation des gereinigten Proteinkomplexes auf die Blattoberfläehe von Malus domestica cv. Holsteiner Cox in vitro Kulturen und die anschließende vergleichende Analyse der Proteinzusammensetzung der Apoplastenwaschflüssigkeit mittels SDS PAGE zeigte eine Veränderung in der Konzentration der Proteine im Apoplasten. Die durchgeführte Subtraktion-Suppressions-Hybridisierung ergab, dass der aufgereinigte Eserase-Protein-Komplex in der Lage ist, eine Stressantwort in der Pflanze auszulösen. Dies ist ein erster Hinweis auf die Perception des Proteinkomplexes durch die Wirtspflanze oder die Generierung von Elicitoren durch den Esterase-Protein-Komplex. Für die genaue Analyse des Wirkmechanismus bedarf es jedoch weiterer eingehender Untersuchungen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2009) Untersuchungen zum epiphytisch lebenden Bakterium Pseudomonas fluorescens Bk3 und dessen Wechselwirkungen mit der Wirtspflanze Malus domestica cv. Holsteiner Cox. Dissertationsschrift Leibniz Universität Hannover
Steinfelder, A.
