Analyse des molekularen Mechanismus der Hsp70 Chaperone

• Antragsteller: Professor Dr. Bernd Bukau; Professor Dr. Matthias Peter Mayer
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2010 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 183020176

Die 70 kDa Hitzeschockproteine agieren in einer Vielzahl zellulärer Proteinfaltungsprozesse. Ihre erstaunliche Vielseitigkeit beruht auf der Fähigkeit, mit ihrer Substratbindedomäne (SBD) transient kurze Sequenzmotive in Proteinen zu binden. Diese Interaktion wird durch einen allosterischen Kontrollmechanismus zwischen Nukleotidbindedomäne (NBD) und SBD reguliert. Dabei hat Hsp70·ATP ein geringe Affinität für Substrate bei gleichzeitig hoher Geschwindigkeitskonstante für Substratbindung und -dissoziation, während Hsp70·ADP eine hohe Affinität für Substrate hat bei geringen Substrataustausch-Geschwindigkeitskonstanten. Die basale ATPase-Aktivität von Hsp70 ist sehr gering, wird jedoch durch das Substratprotein selbst und ein Co-Chaperon der Familie der J-Domänproteine (JDP) synergistisch stimuliert. Nukleotidaustauschfaktoren (NEFs) beschleunigen die Dissoziation von ADP und, bei physiologischen ATP Konzentrationen, die Konversion von Hsp70 in den niedrig-affinen Zustand; sie regulieren damit die Lebensdauer des Chaperon-Substrat-Komplexes.In der zurückliegenden Förderperiode konnten wir substantiell zum besseren Verständnis der Hsp70-Chaperonmaschine beitragen. Unsere Ergebnisse zur Mechanik der Substratbindung änderte die Vorstellung davon, wie Hsp70 mit gefalteten Proteinen, Proteinaggregaten und Amyloiden interagiert. Es gelang uns die Struktur von Hsp70 in der ATP-gebundenen offenen Konformation zu lösen. Eine auf dieser Struktur basierende Mutagenesestudie offenbarte fundamentale Aspekte des allosterischen Regulationsmechanismus. Zudem entdeckten wir, dass JDPs unterschiedlicher Klassen bei der Auslösung von Proteinaggregaten synergistisch miteinander kooperieren, und es gelang uns eine Hsp70-Machinerie zu charakterisieren, welche alpha-Synucleinaggregate effizient auflöst.In der kommenden Förderperiode möchten wir vier Themen von zentraler Bedeutung für das Verstehen des Hsp70-Systems angehen: (i) Basierend auf der jüngsten Kristallstruktur wollen wir die Kinetik der Konformationsänderungen bestimmen, welche durch ATP Bindung an nukleotidfreies Hsp70 und durch Substratbindung an Hsp70·ATP verursacht werden, und wie diese durch Substrate und Co-Chaperone moduliert werden. Diese Untersuchungen sollten nicht nur ein dynamisches Modell der Hsp70 Arbeitsweise sondern auch Information zu Energieübertragung auf Substrate offenbaren (ii) Um zu verstehen, wie JDP die ATPase-Aktivität von Hsp70 stimulieren, werden wir versuchen, die genaue Interaktionsfläche zwischen J-Domäne und NBD von Hsp70 abzustecken und den Einfluss der J-domain auf die NBD Konformation eruieren. (iii) Wir werden die JDP-Substrat-Interaktion untersuchen, um aufzuklären, wie unterschiedliche JDP Klassen Substrate binden, ob und wie sie Änderungen der Konformation der Substrate verursachen, und wie sie Hsp70 zum Substrat dirigieren. (iv) Die Kooperation von JDPs und NEFs wird analysiert werden, um synergistische Aktionen während des Hsp70-Chaperonzyklus aufzuklären.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen