Funktionseinheit Gefrierbruchanlage
Final Report Abstract
Die Methode der Gefrierbruch-Replika-Immunmarkierung (freeze-fracture replica immunolabeling; FRIL) ermöglicht die Darstellung der zellulären Ultrastruktur in Gefrierbrüchen und die gleichzeitige Immunogold- Markierung individueller Proteine. Diese Technik erlaubt die exakte Analyse der zellulären und subzellulären Lokalisation sowie der Topographie identifizierbarer Proteine innerhalb der Membran oder anderer Zellkompartimente. Die Funktionseinheit Gefrierbruchanlage wurde mit dem Ziel beantragt, nach Etablierung der Gefrierbruch- Replika-Immunmarkierung mittels dieser Methode folgende Forschungsprojekte zu bearbeiten: a) Lokalisation von Gap junction-Proteinen, b) Analyse von Proteinen synaptischer Vesikel in der Retina, c) Lokalisation von Ionenkanälen, sowie d) die Analyse des Zahn-Biofilms. Zu a) Mittels der FRIL Methode gelang erstmals die Darstellung der Morphologie von Pannexin (Panx)-Kanälen in eukaryonten Zellen. HEK 293 Zellen wurden mit einem Panx1-EYFP-Konstrukt transfiziert. Panx1-transfizierte Zellen wiesen de novo charakteristische 9,6 nm große Partikel in der Zellmembran auf. Die Detektion mittels anti-GFP-Immunmarkierung zeigte, dass diese P face-Partikel Immunogold-markiert waren. Die Immunmarkierung über Panx1-Antikörper resultierte ebenfalls in der Markierung dieser Partikel. Kontrollzellen (EYFP-N1 Transfektion) wiesen weder charakteristische Partikel noch eine Goldmarkierung auf. Die ultrastrukturelle Analyse der subzellulären Lokalisation und der Anordnung der Pannexin-Kanäle in intakten Zellen zeigte, dass Panx1-Kanäle in der Plasmamembran lokalisiert sind. Zell-Zell-Verbindungen, typisch für Connexin-Gap Junction Kanäle, werden nicht ausgebildet; auch Connexin-typische Plaques wurden nicht beobachtet. Mit der Identifizierung der Panx1-Kanäle in transfizierten Zellen sind nun die Möglichkeiten zur Detektion endogener Pannexin-Kanäle in neuralen Zellen gegeben. In Geweben wurde die FRIL-Methode zunächst für Gap junction Proteine etabliert: Über eine Cx32-Immunogoldmarkierung wurden z.B. Gap junction Plaques in der Leber dargestellt. Die Anwendung der FRIL-Methode ermöglicht nun die weitere Analyse der Gap junction Proteine in der Entwicklung sowie ihrer physiologischen und pathologischen Lokalisation und Funktion im Nervensystem. Zu b) Zur Analyse von synaptischen Transmembranproteinen in der Retina wurden Replikas von Retina- Präparationen angefertigt (Abb. 3). In der äußeren plexiformen Schicht, in der die Photorezeptorsynapsen lokalisiert sind, wurden morphologisch die Fortsätze der Astrozyten über Aquaporin 4 „square arrays“ identifiziert. Cx36, ein neuronales Connexin, wurde in der Retina in „retikulären“ Gap junctions der äußeren plexiformen Schicht detektiert und diente der Identifizierung der Neurone. Aktuell werden Immunmarkierungen mit Antikörpern gegen die Proteine synaptischer Vesikel durchgeführt. Zu c) Bei der Analyse von Calcium-Kanälen ermöglicht die FRIL-Markierung die Zuordnung von Kanal-Isoform, Zelltyp und subzellulärer Lokalisation. Die Lokalisation von Cavß3-, Cavß2B- sowie von TRPV6- Kanalproteinen wurde über eine GFP-Markierung des jeweiligen Proteins in transfizierten HEK 293-Zellen analysiert; parallel wurde die Lokalisation mithilfe primärer Antikörper gegen die Kanal-Proteine verifiziert. Im Gegensatz zu Pannexin-Kanälen, die als sehr große, charakteristische Partikel dominieren, sind die Immunogold-assoziierten Partikel der Calcium-Kanalproteine kleiner und morphologisch kaum von anderen IMPs unterscheidbar. Das palmitoylierte Cavß2B Protein, nicht aber das Cavß3 Protein sollte im Bereich der Plasmamembran lokalisiert sein, unabhängig davon, ob die Zellen das Gen der Ionen-leitenden alpha1 Kanalpore exprimieren. Die Analyse ihrer subzellulären Lokalisation ist daher nur über das Immunolabelling möglich: In den nächsten Schritten werden nun FRIL-Analysen in solchen Organen durchgeführt, welche gleichzeitig die Gene der Cavß3-, Cavß2B- und der Ionen-leitenden alpha1 Kanalpore exprimieren. Zu d) Gefrierbruch-Replikas wurden von 24-Stunden-Zahnbiofilm-Proben angefertigt. Über die Korrelation von REM und TEM Analysen konnten Erkenntnisse zur Darstellung der verschiedenen Biofilmschichten in den Replikas gewonnen werden. Die Immunogold-Markierung charakteristischer Proteine des Zahnbiofilms resultierte in der Lokalisation des kolloidalen Gold in den basalen Biofilm-Schichten, i.e. der Proteinschicht und der inneren Pellikelschicht. Diese Resultate stellen die ersten Gefrierbruch-Immunmarkierungen am Zahnbiofilm dar und stimmen mit den Erkenntnissen aus immunmarkierten elektronenmikroskopischen Schnittpräparaten überein. Die Methode der FRIL konnte an unterschiedlichen Proben (Gewebe, Zellen, Biofilm) erfolgreich etabliert werden. Neben der Detektion von Connexin-Proteinen, für die die FRIL-Methode ausführlich beschrieben wurde, konnte die Markierung von Pannexin-Proteinen etabliert werden. Die Analyse der Proteinkomponenten von Ribbon-Synapsen und die Darstellung verschiedener Ionenkanäle im Gewebe können, basierend auf den durchgeführten Vorarbeiten, durchgeführt werden. Die Möglichkeit der Anwendung der FRIL-Methode in der Charakterisierung des Zahnbiofilms wurde in Pilotstudien gezeigt und wird nun für weitere Komponenten des Biofilms verwandt. Auf Basis dieser methodischen Grundlagen ist nun in allen vier Bereichen die inhaltliche Fortführung der Projekte gebahnt.
Publications
- (2015) Pannexin-1 channels show distinct morphology and no gap junction characteristics in mammalian cells. Cell Tissue Research
Beckmann, A., Grissmer, A., Krause, E., Tschernig, T., Meier, C.
(See online at https://doi.org/10.1007/s00441-015-2281-x)
