Untersuchungen zur Morphogenese des Hepatitis C Virus
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Zentrales Ziel des Projektes war es, molekulare Mechanismen der Morphogenese des Hepatitis C Virus (HCV) zu untersuchen. Hierbei sollte insbesondere die Funktion des HCV p7 Ionenkanals geklärt und die Bedeutung cis-aktiver viraler Determinanten bei der HCV Partikelbildung überprüft werden. Wir konnten zeigen, dass HCV p7 für die Assemblierung und den Export infektiöser Viren essentiell ist. Unsere Versuche belegen, dass p7 Proteine verschiedener HCV Isolate die Virusproduktion mit unterschiedlicher Effizienz unterstützen. Dementsprechend beeinflussen p7 Determinanten die virale Fitness und könnten auf diese Weise zur HCV Pathogenese und Persistenz beitragen. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass p7 starkt genotyp-abhängig am HCV Partikelbildungsprozess mitwirkt. Das heißt, dass ein p7 Protein des einen viralen Genotyps nicht in der Lage ist, die Virusproduktion eines anderen HCV Genotyps zu unterstützten. Diese Befunde sprechen für eine Interaktion von p7 mit anderen viralen Faktoren und eine Genotypabhängigkeit dieser Wechselwirkung. Durch die Entwicklung eines neuen Trans-Komplementationsansatzes, bei dem die Virusproduktion eines HCV Genoms mit einem p7-Defekt durch die Koexpression von wildtyp p7 wiederhergestellt wird, konnten wir nachweisen, dass funktionelle Unterschiede zwischen p7 Varianten unterschiedlicher Genotypen nicht etwa auf unterschiedliche Polyproteinprozessierung zurückzuführen sind. Mit Hilfe dieses Modells haben wir kürzlich ein funktionelles, epitop-markiertes p7 Protein konstruieren, mit dem nun die subzelluläre Lokalisation und die Interaktionen von p7 mit viralen und zellulären Proteinen untersucht werden. Unsere Kartierungen zur Identifizierung essentieller cis-aktiver Determinanten ergab, dass die gesamte Core, E1, E2, p7 und NS2-kodierende-Region deletiert werden kann, ohne die Verpackung der RNA in infektiöse Viren zu verhindern. Auf dieser Grundlage haben wir Verpackungszelllinien zur Produktion infektiöser nicht-ausbreitungsfähiger HCV Partikel konstruiert. Diese Viren ermöglichen Zellkulturinfektionsstudien unter wesentlich verbesserten Sicherheitsbedingungen. Die Rekonstitution der Virusproduktion durch Trans-Komplementation haben wir eingesetzt, um zu prüfen, ob Mausleberzellen dominante Restriktionsfaktoren exprimiert, welche die Replikation und Virusproduktion des HCV unterdrücken. Da in Heterokaryonten zwischen humanen HCV Replikon-Zellen und Mauszellen, welche die fehlenden viralen Strukturproteine exprimieren, infektiöse Viren gebildet werden, können wir ausschließen, dass dominant antiviral-wirkende Faktoren die Vermehrung des HCV in Mauszellen verhindern. Diese Befunde sind wichtig für die Entwicklung immunkompetenter Kleintiermodelle, die für die Forschung an einer HCV-Vakzine dringend benötigt werden. Darüber hinaus haben wir den direkten Einfluss von Immunsuppressiva auf die Vermehrung des HCV in Zellkultur untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Steroide, die beispielsweise nach Lebertransplantation verwendet werden, den Zelleintritt steigern. Dies könnte in vivo die Ausbreitung des HCV nach Transplantation im Spenderorgan fördern und auf diese Weise den Verlauf der HCV Infektion negativ beeinflussen. Durch die gezielte Manipulierung zentraler zellulärer Signalkaskaden konnten wir die zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) als neuen Ko-faktor für die HCV Partikelbildung identifizieren.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Antiviral effects of amantadine and iminosugar derivatives against hepatitis C virus. Hepatology. 2007 Aug;46(2):330-8.
Steinmann E, Whitfield T, Kallis S, Dwek RA, Zitzmann N, Pietschmann T, Bartenschlager R.
- Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. 2007 Jul;3(7):e103.
Steinmann E, Penin F, Kallis S, Patel AH, Bartenschlager R, Pietschmann T.
- Efficient transencapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles. J Virol. 2008 Jul;82(14):7034-46.
Steinmann E, Brohm C, Kallis S, Bartenschlager R, Pietschmann T.
- Cyclosporine A inhibits hepatitis C virus (HCV) NS 2 via cyclophilin A. Hepatology. 2009 Nov;50(5):1638-45.
Ciesek S, Steinmann E, Wedemeyer H, Manns MP, Neyts J, Tautz N, von Hahn T, and Pietschmann T.
- Production of infectious genotype 1b virus particles in cell culture and impairment by replication enhancing mutations. PLoS Pathog. 2009 Jun;5(6):e1000475.
Pietschmann T, Zayas M, Meuleman P, Long G, Appel N, Koutsoudakis G, Kallis S, Leroux-Roels G, Lohmann V, Bartenschlager R.
- Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors. PLoS Pathog. 2010 Jul 1;6:e1000978.
Bitzegeio J, Bankwitz D, Hueging K, Haid S, Brohm C, Zeisel MB, Herrmann E, Iken M, Ott M, Baumert TF, Pietschmann T.
- Glucocorticosteroids increase cell entry by hepatitis C virus: Gastroenterology. 2010 May;138(5):1875-84.
Ciesek S, Steinmann E, Iken M, Ott M, Helfritz FA, Wappler I, Manns MP, Wedemeyer H and Pietschmann T.
- MAP-kinase regulated cytosolic phospholipase A2 activity is essential for production of infectious hepatitis C virus particles. PLoS Pathog. 2012;8(7):e1002829.
Menzel N, Fischl W, Hueging K, Bankwitz D, Frentzen A, Haid S, Gentzsch J, Kaderali L, Bartenschlager R, Pietschmann T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002829) - Hepatitis C Virus p7 is Critical for Capsid Assembly and Envelopment. PLoS Pathog. 2013 May;9(5):e1003355.
Gentzsch J, Brohm C, Steinmann E, Friesland M, Menzel N, Vieyres G, Perin PM, Frentzen A, Kaderali L, Pietschmann T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003355) - Subcellular localization and function of an epitope-tagged p7 viroporin in hepatitis C virus-producing cells. J. Virol. 2013 Feb;87(3):1664-78.
Vieyres G, Brohm C, Friesland M, Gentzsch J, Wölk B, Roingeard P, Steinmann E, Pietschmann T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1128/JVI.02782-12)
