Enzymmarkierte DNA an elektrisch geheizten Elektroden
Final Report Abstract
Die Hauptaufgabe des Projektes, einen heizbaren elektrochemischen Sensor für enzymmarkierte DNA vorzustellen, konnte erfolgreich bearbeitet werden. Hierbei stellte sich in erster Linie die Frage, ob es möglich ist, optimale Elektrodentemperaturen einzustellen, die sowohl eine maximale Aktivität der Enzymmarker, als auch eine thermisch stringente Hybridisierung von DNA-Fängersonden und DNA-Targetsträngen zulassen. Der über Streptavidin-Biotin angebundene Enzymmarker Alkalische Phosphatase zeigte seine maximale Aktivität bei ca. 50 ºC. Etwas darüber lagen die Schmelztemperaturen der verwendeten modellhaften Oligonukleotide. Im Ergebnis fand sich das maximale elektrochemische Hybridisierungs-Signal auch in diesem Bereich, wobei es je nach Anzahl der Fehlpaarungen verschoben wurde. Ein bis drei Fehlpaarungen konnten auf diese Weise erkannt werden. Gleichwohl gab es im Verlauf des Projektes erhebliche Schwierigkeiten einerseits mit dem Substrat Naphthylphosphat, das nach Freisetzung durch die Alkalische Phosphatase und elektrochemische Umsetzung häufig zu Elektrodenfouling führte. Andererseits gab es auch mit der unspezifischen Adsorption enzymmarkierter Oligonukleotide Probleme. Das optimale Assay sieht die Verwendung einer Fängersonden-SAM vor, die über Thiol-Linker an einer heizbaren Goldelektrode immobilisiert wurde, gefolgt von einer max. einstündigen Nachbelegung mit Mercaptohexanol, sowie mit p-Aminophenylphosphat als Substrat. Publiziert wurden bereits mehrere Artikel zu Voruntersuchungen und begleitenden Studien: Reporterstränge mit Enzym- und Liposommarkern, Kohlepasteelektroden mit Meerrettichperoxidase (Temperatureinfluss), Geheizte DNA- und Enzym-Elektroden, Verdrängungsassay mit Osmiumtetroxid als Marker, Analyse von PCR-Produkten bzw. Realproben. Daneben wurden zahlreiche Vorträge und Poster auf internationalen Tagungen präsentiert. Die Publikation zu den Endergebnissen bzw. zur Beantwortung der Hauptfrage befindet sich in der Vorbereitung.
Publications
- Electrochemical detection of osmium tetroxide labeled PCR-products by means of protective strands. Talanta, Volume 74. 2007, Issue 3, pp. 393–397.
T. Reske, M. Mix, H. Bahl, G.-U. Flechsig*
(See online at https://dx.doi.org/10.1016/j.talanta.2007.09.004)
