Zwei-Fokus Fluoreszenz-Korrelations-Spektrometer
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Gerät wurde beschafft, um dynamische Prozesse auf der Längenskala von Nanometern mit hoher zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Dabei standen sowohl die Entwicklung neuer Methoden als auch die Anwendung auf biophysikalische Fragestellungen im Vordergrund. Zu den wichtigsten Projekten zählten: 1. Diffusion und Interaktion von Membranproteinen. Im Rahmen dieses Projekt wurde die Korrelation von Diffusionsgeschwindigkeit und struktureller Größe von Transmembran-Proteinen systematisch untersucht. Präzise Messung der Diffusionskonstanten verschiedener Membranproteine mittels 2fFCS in freistehenden planaren Modellmembranen (sog. Black Lipid Membranes) wurden erfolgreich durchgeführt. Es konnte zweifelsfrei gezeigt werden, dass im Größenbereich bis zu 4 nm die Diffusion durch das klassische Saffman-Delbrück-Modell quantitativ korrekt beschrieben wird. 2. Messungen von Rotationsdiffusion und aktivem Transport. Die ersten Arbeiten in diesem Projekt hatten das Ziel, optimale Messparameter und die erreichbaren Genauigkeiten der gemessenen Diffusionskoeffizienten für Translations- und Rotationsdiffusion zu bestimmen. Unter optimalen Bedingungen konnte eine absolute Genauigkeit beider Diffusionskoeffizienten von 4 % erzielt werden. Diese Genauigkeit ermöglicht es nicht nur, den hydrodynamischen Radius der diffundierenden Moleküle zu bestimmen, sondern bei geeigneten Systemen auch genauere Aussagen über die molekulare Struktur (präziser den Formfaktor) zu treffen. Als weitere Methode wurde die 2fFCS dahingehend erweitert, dass Fließgeschwindigkeit und -richtung mit hoher Ortsauflösung (~1µm) und Genauigkeit zu vermessen. Diese Methode wurde in weiteren Untersuchungen genutzt, um Flussprofile innerhalb geordneter Flüssigkristalle zu vermessen. Erstmals konnte quantitativ vermessen werden, wie stark die lokale Fließgeschwindigkeit um Strömungsdefekte herum zunimmt. 3. Proteinfaltung. Einzelmolekül-Förster-Resonanz-Energietransfer und Einzelmolekül-Photoelektron-Transfer-Messungen sollen zur Untersuchung der schnellen Gleichgewichtsdynamik von Proteinkonformationen unter partiell entfaltenden Umgebungsbedingungen dienen. Die untersuchten Strukturen sind das α-Helix-Turn-α-Helix-Motiv (HTH) des Proteins Engrailed Homeodomain, die WW-Domäne des humanen Pin1 Proteins, sowie die intrinsisch ungeordneten Domänen sog. FG-Repeat-Proteine aus dem Nuclear Pore Complex. Bedingt durch die relativ kleinen Molekülradien konnte bisher für die mit dem Messsystem nutzbaren FRET-Paare keine hinreichende Änderung der FRET-Effizienz beobachtet werden. Die Förster-Radien der Paare liegen bei deutlich über 5 nm. Als Alternative wird die Fluoreszenzlöschung durch photoinduzierten Elektronentransfer (PET) untersucht. Dieser Mechanismus erfordert einen direkten Kontakt zwischen Farbstoff (der Oxazin-Farbstoff Atto655) und Fluoreszenzlöscher, der Aminosäure Tryptophan. Eine Strukturänderung zeigt sich hier als Änderung der Fluoreszenzlöschrate. 4. Struktur und Dynamik vom Proteinkomplexen. In diesem Projekt wurden Änderungen der Protein-Zusammensetzung und des Remodeling des Spliceosoms während seines katalytischen Zyklus untersucht. Mit Hilfe von Zwei-Farben-Fluoreszenz-Kreuzkorrelation wurden der Einbau und die Abspaltung von fluoreszenzmarkierten Untereinheiten untersucht. Ihre Bindung an das Spliceosom wurde während der katalytischen Aktivierung durch Prp2 verfolgt, bei der das Spliceosom vom Zustand Bact in den B* übergeht. Hierbei konnte gezeigt werden, das Cwc24, Cwc27 und Bud13 zunächst fest an den Bact-Komplex gebunden sind. In dem katalytisch aktiven B* fehlen sie dagegen komplett. Dies ist übereinstimmend mit der Beobachtung, dass Cwc24 zwar für den Step 1 des Zyklus notwendig ist, jedoch nicht für den katalytischen Schritt an sich. Die Bindung der Proteine Prp11 und Cus1 aus der U2-SF3a/b Gruppe wurde zwar ebenfalls geschwächt, jedoch blieben sie unter physiologischen Bedingungen größtenteils an das Spliceosom gebunden. Im Gegensatz hierzu verstärkte sich die Bindung von Yju2, das im Bact-Komplex nur schwach gebunden ist, beim Übergang in den B* deutlich. Das stimmt mit der Beobachtung überein, dass dieses Protein an dem Step 1 des Splicings beteiligt ist. In ähnlicher Weise entsteht bei der katalytischen Aktivierung eine hoch affine Bindungsstelle für Cwc25. Die Resultate weisen hierbei eine deutliche Kooperativität der durch das Prp2 verursachten Änderungen an der Struktur des Spliceosoms hin.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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„Self-Diffusion and Cooperative Diffusion in Semidilute Polymer Solutions As Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy” Macromolecules 42 (2009) 9537-9547
Ute Zettl, Sebastian T. Hoffmann, Felix Koberling, Georg Krausch, Jörg Enderlein, Ludger Harnau, Matthias Ballauff
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„Application of dual-focus fluorescence correlation spectroscopy to microfluidic flow-velocity measurement” Lab Chip 10 (2010) 1286-1292
Tyler Arbour, Jörg Enderlein
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„Measuring rotational diffusion of macromolecules by fluorescence correlation spectroscopy” Photochem. Photobiol. Sci. 9 (2010) 627-636
Anastasia Loman, Ingo Gregor, Christina Stutz, Markus Mund, Jörg Enderlein
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“Fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring the rotational diffusion of macromolecules” Chem. Phys. Lett. 516 (2011) 1-11
Christoph Pieper, Jörg Enderlein
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“Lipid Diffusion within Black Lipid Membranes Measured with Dual-Focus Fluorescence Correlation Spectroscopy” ChemPhysChem 13 (2012) 990-1000
Kerstin Weiß, Jörg Enderlein
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“Prp2-mediated protein rearrangements at the catalytic core of the spliceosome as revealed by dcFCCS” RNA 18 (2012) 1244-1256
Thomas Ohrt, Mira Prior, Julia Dannenberg, Peter Odenwälder, Olexandr Dybkov, Nicolas Rasche, Jana Schmitzová, Ingo Gregor, Patrizia Fabrizio, Jörg Enderlein, Reinhard Lührmann
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“Dual-Focus Fluorescence Correlation Spectroscopy” In: Sergey Y. Tetin (Ed.), Methods in Enzymology, Academic Press, Vol. 518 (2013) 175-204
Christoph Pieper, Kerstin Weiß, Ingo Gregor, Jörg Enderlein
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“Flow of a nematogen past a cylindrical micro-pillar” Soft Matter 9 (2013) 1937-1946
Anupam Sengupta, Christoph Pieper, Jörg Enderlein, Christian Bahr, and Stephan Herminghaus
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“Quantify-ing the Diffusion of Membrane Proteins and Peptides in Black Lipid Membranes with 2-Focus Fluo-rescence Correlation Spectroscopy” Biophys. J. 105 (2013) 455-462
Kerstin Weiss, Andreas Neef, Qui Van, Stefanie Kramer, Ingo Gregor, Jörg Enderlein
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“The mechanism of the second step of pre-mRNA splicing investigated in a purified splicing system in S. cerevisiae” RNA 19 (2013) 902-915
Thomas Ohrt, Peter Odenwälder, Julia Dannenberg, Mira Prior, Zbigniew Warkocki, Jana Schmitzová, Ingo Gregor, Jörg Enderlein, Patrizia Fabrizio, Reinhard Lührmann
