Konfokales Lichtmikroskop mit kombinierter 2-Photonen Laserausstattung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen der Berufung von Prof. S.E. Lehnart und Prof. W.-H. Zimmermann an die Universitätsmedizin Göttingen wurde ein kombiniertes Konfokal-/2-Photonen-Mikroskop für multimodale Fluoreszenzmikroskopie für zellbiologische Imaging-Fragen und kombinierte Patch-Clamp- Elektrophysiologie insbesondere von lebenden Herzzellen und Herzgeweben beantragt. Es wurde ein System mit 2-Photonen-Laser beschafft, das eine technische Weiterentwicklung mit verminderter Laserintensität für Lebendzellstudien und verbesserten spektralen Detektoreigenschaften darstellt. Unsere Erfahrungen aus bisher durchgeführten Forschungsprojekten - insbesondere Lebendzellstudien von Herzmuskelzellen – hat die Erwartungen an das Mikroskopsystem teils bestätigt und teils übertroffen (im Vergleich zur Vorläufer-Generation). Zum Beispiel wurden wie geplant kombinierte Struktur-Funktions-Untersuchungen zur Visualisierung und Korrelation von lokalen intrazellulären Calcium-Signalen mit Komponenten des intrazellulären Transvers-Axialen-Membransystems (TATS) in lebenden Herzmuskelzellen durchgeführt. Auch geplante multimodale Anwendungen wie kombinierte Patch-Clamp Aktionspotential- und intrazelluläre Calcium-Messungen wurden erfolgreich etabliert und mit standardisierten Protokollen durchgeführt. Schliesslich wurden sowohl isolierte perfundierte Mausherzen als auch eigens gezüchtete Herzgewebe (sog. EHMs) jeweils mit Konfokal- und 2-Photonen-Mikroskopie untersucht. Insgesamt hat das Grossgerät ein grosses technisches Leistungsspektrum für eine Vielzahl von Forschungsprojekten und Kollaborationen erschlossen. Die wichtigsten Forschungsprojekte (1-5) seit Inbetriebnahme sind: 1) Die Arbeitsgruppe Lehnart untersucht die Struktur und Funktion intrazellulärer Calcium-Freisetzungseinheiten. Es ist gelungen, mit hoher raumzeitlicher Auflösung lokale Calcium-Signale und Membran-Strukturen zu korrelieren. Kombinierte Ionen/Membran-Mikroskopie- Messprotokolle ermöglichen detailierte Untersuchungen von subzellulären Nanodomänen-Funktionen in Herzmuskelzellen transgener Modelle oder pathophysiologisch veränderter Herzzellen aus Krankheitsmodellen. Die hochwertigen spektralen Eigenschaften des Geräts ermöglichen auch den vorteilhaften Einsatz neuartiger Rhodamin-Fluoreszenzfarbstoff-Derivate und strategische Geräte-Kombinationen zwecks technischer Erweiterung und Translation konfokaler Ergebnisse durch neue Superresolution-Mikroskopie-Verfahren (z.B. STED). 2) Am Institut für Pharmakologie (Direktor: Prof. Zimmermann) werden morphologische und funktionelle Analysen an Herzmuskelzellen sowie nativem und gezüchteten Herzgewebe durchgeführt. Dabei werden einerseits Herzmuskelzellreifungsprozesse und auf der anderen Seite Prozesse der pathologischen Herzmuskelzellhypertrophie sowie des pathologischen Herzmuskelremodellings untersucht. Darüber hinaus werden Änderungen der Calciumhomöostase sowie der Spannungsänderungen über funktionelle Bildgebung an Herzmuskelpräparaten analysiert. 3) Die Emmy-Noether Nachwuchsgruppe von Dr. Nikolaev untersucht transgene Mausmodelle mit hochlokalisierten (targeted) FRET-Sensorproteinen zur Lebendzell-Messung zyklischer Nukleotid- Botenstoffe (cAMP und cGMP) in unterschiedlichen Kompartimenten adulter Herzmuskelzellen. Die genaue Lokalisation and Proteinumgebung der FRET-Sensoren konnte mittels Konfokalmikroskopie lebender sowie immungefärbter Zellen charakterisiert werden. 4) Die Arbeitsgruppe Thoms untersucht das Protein Dysferlin bei der Pathogenese von Muskeldystrophien. Durch konfokale Mikroskopie konnte die Lokalisation von Dysferlin und assoziierten Proteinen im Skelett- und Herzmuskel insbesondere in Muskeldystrophie- Mausmodellen charakterisiert werden. 5) Nach der Berufung von Prof. Schwappach an die UMG hat ihre Arbeitsgruppe intensiv die neuen Möglichkeiten zur Zusammenarbeit innerhalb des Herz-Kreislauf-Forschungsschwerpunktes genutzt, um Forschungsfragen zur Biogenese und Sortierung von Membranproteinen im Kontext terminal ausdifferenzierter Zellen wie Kardiomyozyten zu untersuchen. Dabei hat sich eine besonders intensive Kooperation mit der Gruppe Lehnart ergeben. Das System wurde zur vergleichenden Untersuchung der Sortierung von ATP-sensitiven Kaliumkanälen in Kardiomyozyten von Vorhof und Ventrikel eingesetzt. Weiterhin nutzen wir es derzeit, um die Biogenese von C-terminal verankerten Membranproteinen in Kardiomyozyten zu charakterisieren. Beide Projekte stellen zellbiologisches Neuland dar, da fundamentale zelluläre Pathways erstmals im komplexen physiologischen Kontext untersucht werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Differential cardiac remodeling in preload versus afterload. Circulation 122: 993-100 (2010)
Toischer K, Rokita AG, Teucher N, Unsöld B, Preuss L, Becker A, Seidler T, Grebe C, Zhu W, Reuter SP, Gupta SN, Schmidt K, Knöll R, Kuhn M, Schäfer K, Field LJ, Lehnart SE, Maier LS, Hasenfuss G
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PDGF-BB protects cardiomyocytes from apoptosis and improves contractile function of engineered heart tissue. J Mol Cell Cardiol 48: 1316-1323 (2010)
Vantler M, Karikkineth BC, Naito H, Tiburcy M, Didié M, Nose M, Rosenkranz S, Zimmermann WH
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Extracellular Signal-Regulated Kinases 1 and 2 Regulate the Balance Between Eccentric and Concentric Cardiac Growth. Circulation Research 108: 176-183 (2011)
Kehat I, Davis J, Tiburcy M, Accornero F, Saba-El-Leil MK, Maillet M, York AJ, Lorenz JN, Zimmermann WH, Meloche S, Molkentin JD
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Terminal Differentiation, Advanced Organotypic Maturation, and Modeling of Hypertrophic Growth in Engineered Heart Tissue. Circulation Research 109: 1105-1114 (2011)
Tiburcy M, Didié M, Boy O, Christalla P, Doeker S, Naito H, Karikkineth BC, El-Armouche A, Grimm M, Nose M, Eschenhagen T, Zieseniss A, Katschinski D, Hamdani N, Linke WA, Yin X, Mayr M, Zimmermann WH
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Ablation of junctin or triadin exacerbates cardiac ischemia-reperfusion injury via endoplasmic reticulum stress and calpain activation. Cardiovascular Research 94(2): 333-341 (2012)
Caia WF, Pritcharda T, Floreaa S, Lama CK, Hanb P, Zhouc X, Yuand Q, Lehnart SE, Allen PD, Kranias EG
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Cardiac Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and their Assembly into Engineered Heart Muscle. Curr Protoc Cell Biol 55: 23.8.1-23.8.21 (2012)
Soong PL, Tiburcy M, Zimmermann WH
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Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur Heart J Epub PMID:22798560 (2012)
Streckfuss-Bömeke K, Wolf F, Azizian A, Stauske M, Tiburcy M, Wagner S, Hübscher D, Dressel R, Chen S, Jende J, Wulf G, Lorenz V, Schön MP, Maier LS, Zimmermann WH, Hasenfuss G, Guan K
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Krueppellike factor 15 regulates Wnt/β-catenin transcription and controls cardiac progenitor cell fate in the postnatal heart. EMBO Mol Med 4: 992-1007 (2012)
Noack C, Zafiriou MP, Schaeffer HJ, Renger A, Pavlova E, Dietz R, Zimmermann WH, Bergmann MW, Zelarayán LC
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STED live cell super-resolution imaging shows proliferative remodeling of T-tubule membrane structures after myocardial infarction. Circulation Research 111: 402-414 (2012)
Wagner E, Lauterbach MA, Kohl T, Westphal V, Williams GSB, Steinbrecher JH, Streich JH, Korff B, Tuan HTM, Hagen B, Luther S, Hasenfuss G, Parlitz U, Jafri MS, Hell SW, Lederer WJ, Lehnart SE
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Targeted disruption of Hspa4 gene leads to cardiac hypertrophy and fibrosis. J Mol Cell Cardiol 53: 459-468 (2012)
Mohamed BA, Barakat AZ, Zimmermann WH, Bittner RE, Mühlfeld C, Hünlich M, Engel W, Maier LS, Adham IM
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Imaging T-tubules: dynamic membrane structures for deep functions. Cardiovascular Research 98(2): 162-164 (2013)
Kohl T, Lehnart SE
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Parthenogenetic Stem Cells for Tissue Engineered Heart Repair. J Clin Invest 123: 1285-1298 (2013)
Didié M, Christalla P, Rubart M, Muppala V, Döker S, Unsöld B, Rau T, Eschenhagen T, Schwoerer AP, Ehmke H, Schumacher U, Fuchs S, Lange C, Becker A, Wen T, Scherschel JA, Soonpaa MH, Yang T, Lin Q, Zenke M, Han DW, Schöler HR, Rudolph C, Steinemann D, Schlegelberger B, Kattman S, Witty A, Keller G, Field LJ, Zimmermann WH
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Superresolution microscopy in heart – cardiac nanoscopy. J Mol Cell Cardiol 58: 13-21 (2013)
Kohl T, Westphal V, Hell SW, Lehnart SE
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The Four and a Half LIM-domain (FHL) 2 Controls Early Cardiac Cell Commitment and Expansion via Regulating βcatenin-Dependent Transcription. Stem Cells 31: 928-940 (2013)
Renger A, Zafiriou MP, Noack C, Pavlova E, Becker A, Sharkova K, Bergmann MW, El-Armouche A, Zimmermann WH, Zelarayán LC
