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Dynamics and Function of Spin Labelled ABC Transport System Studied by Multi-Frequency EPR

Fachliche Zuordnung Biophysik
Förderung Förderung von 2009 bis 2018
Projektkennung Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 137912997
 
Erstellungsjahr 2018

Zusammenfassung der Projektergebnisse

ABC (ATP binding cassette) -Transporter kommen in allen Organismen vor und vermitteln, energetisch getrieben durch die Hydrolyse von ATP, die Translokation von chemischen Verbindungen über biologische Membranen. Der Aufbau dieser Transportkomplexe ist modular und beinhaltet zwei Transmembrandomänen, durch welche die Translokation des Substrats erfolgt, und zwei Nukleotid bindende Domänen, die ATP binden und hydrolysieren. Für ABC-Importer wurde als Translokationsmechanismus das "alternate access"- Modell postuliert, welches eine ATP-abhängige Konformationsänderung zwischen einem periplasmatisch und einem zytoplasmatisch geöffneten Zustand beschreibt. Prokaryotische kanonische ABC-Systeme verfügen zudem über ein zusätzliches periplasmatisches Substratbindeproteine. Dieses bildet zusammen mit den Transmembrandomänen innerhalb einer Phase des Transportzyklus einen stabilen Komplex, während dessen der Übergang des Substrats erfolgt. Zur Klärung, ob der postulierte Transportmechanismus allgemein für ABC-Importer gültig ist, wurde die Konformationsdynamik spinmarkierter Varianten des Histidin-Transporters HisQMP2 aus Salmonella Enterica Serovar Typhimurium und die Dynamik der Wechselwirkung des Transportkomplexes mit dem Bindeprotein HisJ während des Transportzyklus mittels Elektronenspinresonanzspektroskopie (ESR, DEER, 2H-ESEEM) untersucht. Die in fünf verschiedenen Bereichen des Proteinkomplexes mittels DEER durchgeführten Spin-Spin Abstandsmessungen zeigen Konformationsänderungen der Transmembrandomänen, die mit den beobachteten offenen, halboffenen und geschlossenen Konformationen der ATP-Bindedomänen korrelieren. Weiterhin konnten die substratabhängige Konformationsdynamik des Bindeproteins HisJ und dessen Wechselwirkungen mit dem nukleotidgebundenen HisQMP2 nachgewiesen werden, die experimentell ermittelte Abstände sind mit der Orientierung des HisJ in einem Dockingmodell vereinbar. Erstmals gelang der Nachweis eines deuterierten Histidinmoleküls in HisM über Spinmarkierung unter Anwendung von 2H-ESEEM. Eine zweite Fragestellung betraf die Konformationsdynamik der ECF (energy-coupling-factor)-Transporter, die gleichermaßen den Transport von Nährstoffen oder Metallionen über Membranen vermitteln. Als Modellproteine dienten hier spinmarkierte Varianten des Biotintransporters BioMNY und des Co2+-Importers CbiMNOQ aus Rhodobacter capsulates. DEER- basierte Abstandmessungen zeigen, dass die ATP-bindenden Domänen ein ATP- und substratabhängiges Öffnen und Schließen aufweisen, so wie es für kanonische ABC-Transporter belegt ist. Eine ATP-abhängige relative Verschiebung der Untereinheiten BioM und BioN konnten wir nachweisen. Die Untersuchung verschiedener Teilkomplexe des CbiMNOQ mittels ESR zeigte die für eine Co2+-Bindung notwendige Wechselwirkung zwischen CbiM und CbiN.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

 
 

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