Analysis of dynamic protein-protein interactions in Chlamydomonas using QUICK-X, a novel quantitative mass spectrometry-based approach
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Hauptziel des Projektes war die Anwendung der QUICK-Methodik (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knock-down) zur Identifizierung von Interaktionspartnern zahlreicher Zielproteine in Chlamydomonas reinhardtii sowie die Analyse der Dynamik dieser Interaktionen. Weiterhin sollte die QUICK-Methodik von der Markierung von Proteinen durch schwere Aminosäuren auf Markierung durch 15N aus Ammonium- oder Kaliumsalzen umgestellt werden. Während die Methodik zur 15N-Markierung des Chlamydomonas-Proteoms problemlos etabliert werden konnte, führte die Entdeckung eines eklatanten Mangels der QUICK-Technologie früh zu einer Umgestaltung des Projektes. Dieser Mangel bestand darin, dass die QUICK-Technologie auf der RNAivermittelten Herabregulierung des Zielproteins beruht unter der Annahme, dass diese ohne Konsequenzen auf das Proteom bleiben. Dies ist vor allem bei Proteinen mit zahlreichen Funktionen – wie in unserem Falle molekulare Chaperone – nicht gegeben. Wir haben demnach erfolgreich drei alternative Strategien verfolgt, um dieses Problem umgehen bzw. dessen Konsequenzen abschätzen zu können. Erstens haben wir zwei neue, mit quantitativer Massenspektrometrie und 15N-Markierung arbeitende Verfahren zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen entwickeln können, die auf Affinitätsmodulation und auf Epitop-Titration basieren und keine Herabregulation des Zielproteins erfordern. Zweitens konnten wir ein System für die induzierbare Expression künstlicher microRNAs für Chlamydomonas entwickeln. Durch eine konditionelle Unterexpression des Zielproteins kann die QUICK-Methode in einem frühen Zeitfenster eingesetzt werden, also bevor es zu erheblichen Umstrukturierungen im Proteom kommt. Drittens haben wir mit dem „universellen 15N-Standard“ und der Entwicklung einer cloud-basierten Software für große 15N-basierte Datensätze eine Methodik etabliert, mit der die Dynamik zellulärer Proteome zeitaufgelöst erfasst werden kann. Somit können die Auswirkungen der Herabregulation eines Zielproteins auf das zelluläre Proteom verfolgt werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2010) An inducible artificial microRNA system for Chlamydomonas reinhardtii confirms a key role for heat shock factor 1 in regulating thermotolerance. Curr. Genet. 56, 383-389
Schmollinger, S., Strenkert, D., and Schroda, M.
- (2011) Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteomics, 10, M110 004739
Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., and Schroda, M.
- (2012) A protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15N metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation. J. Vis. Exp.,67, 4083
Schmollinger, S., Strenkert, D., Offeddu, V., Nordhues, A., Sommer, F. and Schroda, M.
(Siehe online unter https://doi.org/10.3791/4083) - (2012) Evidence for a role of VIPP1 in the structural organization of the photosynthetic apparatus in Chlamydomonas. Plant Cell, 24,637-659
Nordhues, A., Schöttler, M.A., Unger, A.K., Geimer, S., Schönfelder, S., Schmollinger, S., Rütgers, M., Finazzi, G., Soppa, B., Sommer, F., Mühlhaus, T., Roach, T., Krieger- Liszkay, A., Lokstein, H., Crespo, J.L., Schroda, M.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1105/tpc.111.092692)
