Einzelmolekül-Assembler
Plant Sciences
Final Report Abstract
Der Zugang zu nanoskaligen Strukturen führt im Wesentlichen über zwei aufeinander zulaufende Pfade: top down oder bottom up. Letztern Weg hatten schon in den frühen Tagen der Nanosciences einige Gruppen beschritten - allen voran Don Eigler - die neue Arrangements einzelner Atome mittels STM-Manipulation kreierten und damit neuartige quantenmechanische Phänomene studieren konnten. Vergleichbare Strategien, um Biomoleküle zu neuen funktionalen Arrangements zusammenzubauen, scheiterten zunächst an den in diesen Systemen wesentlich komplexeren Wechselwirkungen. Unserer Arbeitsgruppe gelang dies zu ersten Mal mit der Entwicklung der Single-Molecule Cut&Paste (SMC&P) Technik. Diese erlaubt es, Biomoleküle mit Nanometer-Präzision auf Oberflächen anzuordnen, wobei das Konzept auf einem hierarchischen Kraftsystem beruht. Sie kombiniert die Å-Präzision des AFMs mit der hervorragenden Selektivität der DNA-Hybridisierung. Dieses hier beschriebene Großgerät, der "Einzelmolekül-Assembler" wurde speziell für diese Belange der Assemblierung von Biomolekülen unter physiologischen Bedingungen entwickelt und aufgebaut. Es besteht im Wesentlichen aus einem Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskop mit ATR-Anregung durch das Objektiv mit einem AFM-Kopf, der den oberen Halbraum belegt. Wichtigstes Konstruktionsmerkmal sind extreme Kompaktheit und die starre Verbindung zwischen AFM-Basis und Objektiv, um die nötige mechanische Stabilität zu gewährleisten. Zur Validierung des Instruments wurden zuerst Bindungsstellen-Muster aus einzelnen Liganden auf Oberflächen Molekül-für-Molekül deponiert, auf die dann in selbstorganisierten Prozessen weitere nanoskalige Objekte binden konnten. Außerdem wurde gezeigt, dass SMC&P herangezogen werden kann, um Eich-Standards für hochauflösende Mikroskopiemethoden zu erzeugen. Am Beispiel der BLINK-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von programmierbaren, kontrolliert hergestellten Mustern auf Oberflächen als Kalibrierungsstandards verwendet werden können. Mit Hilfe dieser konnte gezeigt werden, wie das Auflösungsvermögen von systemrelevanten Parametern, z.B. der chemischen Umgebung, abhängen. SMC&P wurde zudem genutzt, um den grundsätzlichen Nachweis der Machbarkeit einer mechanisch kontrollierten funktionalen Assemblierung auf der Grundlage von einzelnen Molekülen zu erbringen. Hierfür wurden zwei RNA-Stränge, die jeder für sich keine Funktion tragen, mit Hilfe von SMC&P so zueinander positioniert, dass sich aus der Interaktion der Stränge eine neue Funktion ergab. Der zusammengefügte RNA-Komplex konnte als Aptamer das kleine Farbstoffmolekül Malachit-Grün erkennen. Durch das Binden verstärkte sich die Quanteneffizienz des Farbstoffs um drei Größenordnungen, so dass die neue Funktion durch klare Fluoreszenzsignale, die kurz aufblinkend auftraten, auslesbar war. Außerdem wurde die Technik, die zunächst auf den Transport von Nukleinsäuresträngen beschränkt war, so erweitert, dass auch Proteine transferiert werden konnten. Um dies zu erreichen wurde zunächst gezeigt, dass sich die Bindung zwischen einem Antikörperfragment und einem Antigen-Peptid in das DNA-basierte Kraftsystem so einfügen lässt, dass die Antikörperfragmente am Cantilever genutzt werden können. Dazu wurden die unterschiedlichen Abhängigkeiten der Abrisskräfte von Ladungsraten von den verschiedenen Bindungen ausgenutzt, um die Abrisskräfte aufeinander abzustimmen. Es wurde ein Fusionsprotein geschaffen, bei dem das Antigen-Peptid am N-Terminus eines GFP-Moleküls und am C-Terminus sechs Zinkfinger ko-exprimiert wurden. Über die Zinkfinger konnte das Fusionsprotein einen Komplex mit einer fluoreszent markierten DNA bilden, die im SMCP-Prozess als Anker diente. Mit Hilfe des Antikörperfragments am Cantilever konnten die GFP-DNA-Komplexe zu grossskaligen aus mehreren Hundert Molekülen bestehenden Mustern zusammengefügt werden was unterstreicht, dass die SMC&P robust und gleichzeitig schonend für die Proteine ist.
Publications
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