Zentralobjekt für standartisierte Synthese, Analytik sowie in vitro- und in vivo-Untersuchungen zu magnetischen Nanopartikeln
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Aufgaben des Zentralprojektes der KFO 213 waren (a) die Synthese von Monomer-stabilisierte Eisenoxid- Nanopartikeln (MEON), im Speziellen Citrat-stabilisierte MEON (VSOP), (b) orientierende toxikologische und pharmakokinetische Untersuchungen zu den MEON und (c) histologische Arbeiten. Es wurden (a) eine neue Fällmethode unter Verwendung des Cold Chelation Prozesses erarbeitet, mit der Partikelkerne mit besser definierten Oberflächeneigenschaften und optimierter Bindung des Hüllmaterials hergestellt werden können, wodurch sich die Voraussetzungen für eine Überführung in standardisierte Synthesebedingungen verbessern. (b) Es wurde gezeigt, dass Partikel aus dieser Fällmethode gut verträglich und magnetisch wirksam sind und (c) zusammen mit TP-02 und TP-03 herausgearbeitet, dass die Wechselwirkung der VSOP mit den GAG-Komponenten der ECM über eine Transchelierung erfolgen könnte. Des Weiteren wurden (d) die Gewebeprozessierung und histochemischen Färbemethoden für den Nachweis von GAGs optimiert. Im Rahmen der Partikelsynthese wurde im Speziellen eine VSOP-Variante entwickelt, bei der die Eisenoxidkerne mit einem geringen Anteil an Europium (Eu) dotiert werden (Eu-VSOP). Hierbei wird Eu als Europiumsalz in entsprechender Menge während der Primärfällung der Partikel zugefügt. Hintergrund ist, dass hierdurch die VSOP mittels Fluoreszenz qualitativ im histologischen Schnitt und analytisch quantitativ z.B. in Blutproben oder Gewebeaufschlüssen nachgewiesen werden können. Dies ermöglicht die eindeutige Diskriminierung des VSOP-Eisens von endogenem Eisen, das vor allem in pathologisch verändertem Gewebe, wie z.B. atherosklerotischen Plaques in größeren Mengen vorliegen kann. Daher hat die Eu-Dotierung der VSOP für die Bestimmung der Organverteilung und Pharmakokinetik von VSOP gegenüber der unspezifischen Berliner Blau Färbung oder der Eisenanalytik Vorteile und ist bei Weitem weniger aufwändig, als eine Radioisotopenmarkierung der VSOP-Kerne. Voraussetzung war die Entwicklung einer geeigneten Enhancer-Lösung, die die Lichtenergie in einer am Fluoreszenzmikroskop möglichen Wellenlänge auf die Eu-Ionen überträgt. Diese Technik wurde in der Laufzeit der KFO 213 entwickelt und in den TP-02, TP-04, TP-06 und TP-07 zu Untersuchungen der Verteilung von VSOP im Gewebe eingesetzt und steht auch dem nachfolgend eingerichteten SFB 1340 „Matrix in Vision“ zur Verfügung. Eine weitere Detektionsmöglichkeit für Eu-VSOP im histologischen Präparat ist die Laser-Ablation-induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (LA-ICP-MS). Auch hier gelingt durch elementmikroskopischen Nachweis des Eu eine eindeutige Differenzierung vom endogenen Eisenhintergrund (TP-08). Das TP-Z hat das TP-08 bei der Kopplung von Annexin A5 an die VSOP für die in vivo Bildgebung der Apoptose unterstützt. Unter Anwendung optimierter Fixiertechnik konnte im histologischen Präparat des experimentellen atherosklerotischen Plaques nach i.v. Injektion von VSOP (TP-03) mittels der Alcian-Färbung mit kritischer Elektrolytreihe nachgewiesen werden, dass das VSOP-Eisen mit GAG-haltigen Strukturen, insbesondere an sog. kalzifizierenden Mikrovesikeln kolokalisiert, und dass diese GAGs stark sulfatiert sind. Dieser histochemisch erhobene Befund wird im SFB 1340 „Matrix in Vision“ unter Anwendung von molekularbiologischen Methoden und biochemischer Analytik weiterführend untersucht. Anhand der in den Projekten TP-02 und TP-03 erhaltenen Befunde, dass die Bindung von VSOP an Zelloberflächen oder auch in der EZM durch GAGs über eine Transchelierung vermittelt wird, wurde im TP-Z die ergänzende Hypothese aufgestellt, dass auch Gadolinium (Gd) als 3-wertiges Kation von GAGs komplexiert werden kann und ebenfalls im Sinne einer Transchelierung aus den Komplexen der Gdbasierten MRT-Kontrastmittel gelöst werden kann. Um dies zu prüfen wurden NMR 1H relaxometrische Untersuchungen an Mischungen von Heparin als Modellsubstanz für GAGs und verschiedenen klinisch zugelassenen Gd-basierten Kontrastmitteln durchgeführt. Es zeigte sich mit abnehmender Stabilitätskonstante der Gd-basierten Kontrastmittel eine Zunahme der T1-Relaxivität des Gd, was nur durch eine Transchelierung von Gd-Ionen an Heparin unter Bildung makromolekularer Gd-GAG-Komplexe zu erklären ist. Für die sog. makrozyklischen Gd-Kontrastmittel-Komplexe mit hoher Stabilitätskonstante ist dieser Effekt nur minimal. Voraussetzung für die Transchelierung ist die Anwesenheit von alternativen Kationen, die das Gd in dem Kontrastmittelkomplex ersetzen. Im genannten Versuch wurde der Lösung ZnCl2 zugegeben, dies in Konzentrationen, die physiologisch möglich sind. Dieses Phänomen wird im nachfolgend eingerichteten SFB 1340 „Matrix in Vision“ weitergehend untersucht.
