Funktionalisierung superparamagnetischer Nanopartikel als Plattform für targetspezifische Marker für die MRT und deren Anwendung für die Apoptose-Bildgebung
Orthopaedics, Traumatology, Reconstructive Surgery
Final Report Abstract
Ziel dieses Projekts war es, mit Annexin A5-VSOP eine optimierte Apoptose-Sonde für die MRT zu entwickeln und in vivo zu validieren. Aufgrund der gegenüber Annexin A5-CLIO-Cy5.5 deutlich verminderten Größe von Annexin A5-VSOP wurden verbesserte biologische Eigenschaften wie z.B. eine erhöhte Bioverfügbarkeit und schnellere Anreicherungskinetik im Zielgewebe erwartet. Die ursprünglich geplanten Methode, Annexin A5 elektrostatisch mittels Protamin bzw. anderer, positiv geladener Peptide an die negative geladene Zitronensäurehülle der VSOP zu koppeln, hat nicht zu guten Partikel-Eigenschaften unter in vivo Bedingungen geführt, was vor allem an einer geringen Stabilität lag. Wir konnten aber eine alternative, sehr gut reproduzierbare, kovalente Kopplungsmethode der Annexin A5-Proteine an die Zitronensäurehülle der VSOP entwickeln. Diese beruhte auf der Aktivierung der Carboxygruppen der Zitronensäurehülle mittels EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]-carbodiimidhydrochlorid) und der Reaktion des instabilen Zwischenprodukts mit Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid). Die resultierenden, semi-stabilen, aktivierten Sulfo-NHS-VSOP-Zwischenprodukte waren durch die negative Ladung von Sulfo-NHS weiterhin effektiv elektrostatisch stabilisiert. Aufgrund der ausreichenden chemischen Stabilität liessen sich diese durch Größenfiltration effizient reinigen. Die anschliessende Kopplung mit Annexin A5 war so effektiv, dass die Oberfläche der VSOP weitgehend mit dem körpereigenen Annexin A5 abgedeckt werden konnte, was eine hohe Biokompatibilität und Targetspezifität ergab. Die Synthese konnte soweit optimiert werden, dass größere Mengen hergestellt werden konnten. Nachdem in vitro ein gutes Targeting von apoptotischen Zellen nachgewiesen werden konnte, haben wir Annexin A5-VSOP erfolgreich in vivo in einem Herzinfarkt-Mausmodell für die MRT- Bildgebung des geschädigten, apoptotischen Herzgewebe getestet. Basierend auf den Arbeiten an Annexin A5 und dem zuvor neu entwickelten, unstrukturierten Polypeptid XTEN, das eine E. coli-exprimierbare, weniger immunogene Alternative zu Polyethylenglycol (PEG) darstellt, aber im Gegensatz zu PEG biologisch abbaubar ist, haben wir die länger zirkulierende Bildgebungssonde XTEN288-Annexin A5 entwickelt. Dadurch konnte die ursprünglich sehr kurze Bluthalbwertszeit von ca. 7 min. in Mäusen auf etwa 1h verlängert werden, wodurch eine verbesserte Apoptose-Bildgebung erreicht werden konnte. Diese stellte die erste Bildgebungssonde dar, die auf dem zu PEG alternativen höchst biokompatiblen XTEN beruht. Auf XTEN-Basis wurde darüber hinaus ein erster Prototyp eines komplett in E. coli-exprimierbaren, multifunktionellen, zytostatischen Fusionsproteins (XTEN-Killin) entwickelt, das bereits bei der Expression alle Funktionen, wie Protease-Aktivierbarkeit, lange Blutzirkulation, Zell-Internalisierungssignal und zytostatische Aktivität enthält. Durch das Design dieser deaktivierten Prodrug wurde die Expression von Killin in E. Coli erst möglich, wohingegen Killin selbst in E. coli nicht exprimierbar war. XTEN-Killin stellt einen Ausgangspunkt für die Entwicklung von multifunktionellen, komplett in E. coli exprimierbaren Medikamenten dar.
