In-situ-Abtrennung von extrazellulären Proteinen mittels Magnetseparation und Darstellung der Rückwirkung auf den Bioprozess
Final Report Abstract
Im Rahmen dieses Projekts wurde die in-situ Magnetseparation (ISMS) in die Produktionsprozesse zur Herstellung der extrazellulären Enzyme Protease und Phytase sowie lysozymspezifischer Antikörperfragmente D1.3 integriert. Mehrstufige Fed-Batch Verfahren wurden unter Verwendung synthetischer und komplexer Medien etabliert. Dabei wurden Biotrockenmassen- und Zielproteinkonzentrationen von bis zu 48 g/L bzw. 2 g/L erreicht. Diese Kultivierungen dienten dazu, eine Basis und Referenz für die integrierten Prozesse mit ISMS zu schaffen und den eventuellen Nutzen der ISMS evaluieren zu können. Die sequentielle Abtrennung wurde so in die Prozesse implementiert, dass das Zielprotein im Optimalfall nach der ISMS nachproduziert wurde. Auf diese Weise konnte die Gesamtausbeute an Protease in Bacillus licheniformis (Wildtyp) Kultivierungen nach sechs sequentiellen Separationsschritten um 98 % gegenüber Kultivierungen ohne Abtrennung gesteigert und die Protease vor proteolytischem Abbau im Reaktor bewahrt werden. Die Prozessimulation zeigte, dass mehr als sechs ISMS Schritte die Ausbeute nicht signifikant steigern konnten. Somit konnte der Partikeleinsatz durch die Simulation optimiert werden. Die Protease-Abtrennung erfolgte mit Hilfe Bacitracin-funktionalisierter Magnetpartikel, die in bis zu 30 Adsorptions- und Elutionszyklen erfolgreich eingesetzt wurden. Die ISMS von rekombinanten Antikörperfragmenten aus E. coli Fermentationen mittels PVA-IDA Metall- Chelat und Triazin-funktionalisierten Partikeln brachte keine Steigerung der Gesamtausbeute an D1.3, da das Zielprotein im Reaktormedium keinem Abbau unterlag. Es konnte aber gezeigt werden, dass beide Partikeltypen prinzipiell für die selektive Abtrennung von hisgetaggten Proteinen gut geeignet sind. Maximale Beladungen von bis zu 80 mg/g konnten für die Triazin-Partikel gemessen werden, die damit ihr Potential zur selektiven Abtrennung von Antikörperfragmenten neben IgG-Antikörpern unter Beweis stellten. Die Verwendung von Metall-Chelat-Partikeln muss kritisch betrachtet werden, da das Kultivierungsmedium mit Schwermetallionen kontaminiert wird, die sich negativ auf das Wachstum und Produktion auswirken können. Ionentauscher-funktionalisierte, magnetische Mikrosorbentien wurden zur Separation rekombinanter Phytase aus E. coli Fermentationen eingesetzt. Es konnte jedoch keine signifikante Adsorption von Phytase und Gesamtprotein an die Partikel aus der Biosuspension gemessen und damit der Einfluss der ISMS auf den Bioprozess nur unzureichend untersucht werden. Allerdings konnte kein signifikanter Abbau der Phytase im zellfreien Medium gemessen werden, was auch hier keinen Vorteil der ISMS in Hinblick auf Ausbeutesteigerungen vermuten lässt. Es zeigte sich jedoch überraschenderweise, dass die Ionentauscher-Partikel in der Lage waren, große Mengen der Biomasse zu adsorbieren bzw. zu flocken. Aus diesem Grund wurden unfunktionalisierte Silica-Magnetpartikel zur Separation von Süß- und Seewasser-Algen eingesetzt, da hier gesteigerter Bedarf besteht, die Kosten im Downstream-Processing zu senken. Die eingesetzte Magnetpartikelmenge sowie der pH im Medium während der Abtrennung und die Medienzusammensetzung wurden als wichtige Separationsparameter identifiziert. Es konnten Separationseffizienzen von > 95 % erzielt werden.
Publications
- “Advantages of In-Situ Magnetic Separation for Extracellular Protease Production”; European Symposium on Biochemical Engineering Science (ESBES), Faro, Portugal, 2008
Cerff, M., Käppler, T., Ottow, K., Hobley, T., Posten, C.
- (2009). "In-Situ Magnetic Separation for Extracellular Protein Production." Biotechnology and Bioengineering 102(2): 535-545
Käppler, T., Cerff, M., Ottow, K., Hobley, T. and Posten, C.
- "Repeated In-situ Magnetic Separation of subtilisin from Bacillus licheniformis Fermentation: an Integrated Approach”; European Symposium on Biochemical Engineering Science (ESBES), Bologna, Italien, 2010
Cerff, M., Scholz, A., Posten, C.
- “In-situ magnetic separation of functional extracellular proteins produced by Escherichia coli”; Vortrag; European Congress on Applied Biotechnology (ECAB), Berlin, 2011
Scholz, A., Cerff, M., Posten, C.
- “In-situ product removal (ISPR) of functional proteins from prokaryotic cultivations by high specific magnetic separation”; American Filtration Society (AFS), Louisville, Kentucky, USA, 2011
Scholz, A., Cerff, M., Posten, C.
