Evaluation der Wirksamkeit lokaler Gentherapie bei CNG Kanal-difizienten Mausmodellen für erbliche Netzhauterkrankungen
Final Report Abstract
Erbliche Netzhautdegenerationen sind eine Gruppe seltener, aber schwerwiegender Augenerkrankungen. Charakteristisch sind Funktionsausfälle der Netzhaut, die bis zur Erblindung führen können, und für die es z. Zt. keine kurativen Behandlungsansätze gibt. Im Berichtszeitraum wurde in einem Tandem-Projekt zwischen Tübingen und München die Wirksamkeit einer lokalen Genersatztherapie für jeweils eine Form der erblichen Netzhauterkrankungen mit Funktionsverlust des Zapfensystems (Achromatopsie ACHM2, CNGA3-/- Mausmodell) und des Stäbchensystems (Retinitis Pigmentosa, CNGB1-/- Mausmodell) evaluiert. In der konkreten Durchführung ergaben sich folgende Schwerpunkte: a) Entwicklung, Klonierung, Produktion und Testung von Lentiviralen Vektoren bzw. Adeno-assoziierten Virus (AAV)–Vektoren, b) Etablierung und Optimierung einer geeigneten Injektionstechnik für das Mausauge, c) Adaption der diagnostischen funktionellen und bildgebenden in vivo Methoden an das therapierte Mausauge, d) Evaluierung viraler Vektoren zur Genersatztherapie erblicher Netzhauterkrankungen im Mausmodell. Durch Verwendung von AAV-Vektoren in Kombination mit der qualitativen Beurteilung des operativen Eingriffs und der Optimierung kritischer Parameter, wie Injektionsvolumen, Kapsid- und Promoter- Spezifität, Wahl des Applikationsortes (dorsal vs. ventral) und Alter zum Therapiebeginn konnte für das Achromatopsie-Modell ein erfolgreicher "proof-of-concept" zur Genersatztherapie erbracht werden. Die funktionelle Beurteilung des Therapieerfolgs wurde an drei Abschnitten des visuellen Signalweges nachgewiesen: 1) Retina: Die zapfenspezifische Expression des erfolgreich eingebrachten CNGA3 Gens führt zur korrekten Bildung des exogenen Proteins, das mit der zweiten endogenen Kanaluntereinheit (CNGB3) funktionelle Heterotetramere bildet, die in das Außensegment der Zapfenzelle transportiert werden. Die neu generierten Kanalkomplexe aktivieren die in den knockout Tieren inaktive Phototransduktionskaskade und ermöglichen somit die Generierung von Zapfen-vermittelten Lichtanworten. Detaillierte funktionelle Untersuchungen zeigten, dass die Zapfen-vermittelten Signale an nachgeschaltete Bipolarzellen weitergeleitet werden. Die Restaurierung der Funktion führte zur Normalisierung des cGMP-Spiegels und zu einer verzögerten Degeneration der Zapfenzellen. 2) Ganglienzellen: Messungen der Ganglienzellaktivität von therapierten Tieren zeigten, dass nach Therapie zapfenspezifische, lichtabhängige Aktionspotentiale erzeugt wurden. 3) Gehirn: über einen speziell für die Fragestellung etablierten Verhaltenstest konnten wir nachweisen, dass therapierte Mäuse ähnlich wie Kontrollmäuse die Fähigkeit besitzen, unter Zapfen-vermittelten Lichtbedingungen Farbkontraste zu diskriminieren. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass es möglich ist, relevante zerebrale Bereiche durch Wiederherstellung von seit Geburt an funktionslosen Signalwegen über eine AAV-vermittelte Genersatztherapie zu aktivieren und damit die Erkrankung auch mit den über die Netzhaut hinausgehenden Auswirkungen erfolgreich zu behandeln. Die positiven Langzeitergebnisse, 1 1/2 Jahre nach Therapiebeginn, lassen auf neue Optionen zur Vorbeugung und Behandlung erblicher Netzhauterkrankungen beim Menschen hoffen. Erste Ergebnisse von rAAV-behandelten CNGB1 knockout Mäusen zeigen einen ähnlich zu beurteilenden Therapieerfolg: die Expression des exogenen Proteins im Außensegment der Stäbchen-Photorezeptorzelle konnte histologisch ebenso wie funktionell (in Form verbesserter Stäbchen-vermittelter Lichtantworten und Sehverhalten) nachgewiesen werden.
