Molecular Determinants of Lyssavirus-Replication
Final Report Abstract
Das Projekt befasste sich mit der Identifizierung von zellulären Determinanten der Lyssavirus-Replikation. Bisher nicht verstandene molekulare Mechanismen der Virusadaptation an unterschiedliche Wirtsreservoire sollten untersucht werden. Mit unterschiedlichen Lyssaviren wie dem klassischen, in terrestrischen Säugetieren vorkommenden Rabies Virus (RABV) und fledermausadaptierten Lyssaviren (Europäische Fledermaus Lyssavirus; EBLV), sollten überprüft werden, ob zelluläre Faktoren als Ago- oder Antagonisten an virale Replikationskomplexe binden und ob wirts- oder virusspezifische Unterschiede existieren, die eine molekulare Anpassung an Reservoirwirte erklären könnten. Neben der Entwicklung von Strategien zur Reinigung viraler Replikationskomplexe erforderte dieser Ansatz die Entwicklung eines neuen reverse genetics Systems für fledermausassoziierte Lyssaviren. Mit der Etablierung eines solchen Systems für das EBLV-1 Virus wurden erstmals Lyssaviren generiert, deren Ursprungsvirus eine sehr enge Bindung an sein Fledermaus-Reservoir aufweist. Mit RABV und EBLV-1 basierten reverse genetics Systemen wurden Viren hergestellt, die Affinitätstag-markierte Proteine zur Reinigung von Replikationskomplexen exprimierten. Mit rekombinanten RABV konnten erstaunlich effizient Replikationskomplexe gereinigt werden, ohne dass die an Nukleoprotein oder L-Polymerase fusionierten Affinitätstags mit der Virusreplikation interferierten. Trotz einer effizienten Reinigung und hoch sensitiven massenspektrometrischen nanoLC MALDI-TOF/TOF Analyse der Proteinkomplexe konnten nur überraschend wenige spezifisch bindende Zellfaktoren identifiziert werden. Obwohl niedrig-affine und transient bindende Faktoren nicht ausgeschlossen werden konnten, deuten die Untersuchungen stark darauf hin, dass die zytoplasmatische Replikation von Lyssaviren relativ unabhängig von direkt bindenden Zellproteinen erfolgt und dass eine molekulare Adaptation der Virusreplikation auf dieser Ebene unwahrscheinlich ist. Mit der Identifizierung der Argininosuccinat-Synthetase (ASS1) als ein Zellprotein, dass sowohl mit RABV als auch mit EBLV-1-Komplexen isoliert wurde und dessen Anreicherung mit der Menge an L-Polymerase in den Proteinkomplexen korrelierte wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Interaktion von lyssaviralen Komplexen mit ASS1 die Arginin-Synthese beeinflusst und möglicherweise das Substrat für eine effiziente NO- Synthese in virusinfizierten Geweben limitiert. Erhöhte ASS1 Mengen in virusinfizierten Maushirnen deuten stark auf eine Rolle der ASS1 bei antiviralen Reaktion hin. Die weitere Bearbeitung dieser Hypothese und insbesondere der direkte funktionelle Zusammenhang zwischen ASS1 und einer antiviralen oder immunmodulatorischen Reaktionsmustern sind Gegenstand weiterer Arbeiten. Anders als bei den Proteinanalysen wurden mit Viruschimären, in denen Gene über die Speziesgrenzen hinaus ausgetauscht wurden, Unterschiede zwischen RABV und EBLV-1 sichtbar. Ein EBLV-1 Matrixprotein (M) exprimierendes RABV zeigte, dass die RABV und EBLV-1 M Proteine hinsichtlich ihrer Membranspezifität unterschiedlich sind und die Orte der Viruspartikelbildung bestimmen. Da die beobachteten Effekte unabhängig von den infizierten Zellen (Zellen aus Nicht-Fledermäusen und Fledermäusen) waren, wurde eine wirtsadaptierende Rolle allerdings ausgeschlossen. Weiter zeigten Glykoprotein (G) Chimären, dass über die Virusspeziesgrenzen hinaus Teilsequenzen der RABV und EBLV-1 G Proteine kombiniert werden können. Dies ermöglichte Pathogenesestudien, in denen deutlich wurde, dass die EBLV-1 Ektodomäne für eine Steigerung der Neuroinvasivität und Pathogenese des „attenuierten“ RABV im Mausmodell ausreicht und demnach das Potential besitzen Neuroinvasion und Pathogenese in Nichtfledermauswirten entscheidend zu bestimmen. Die Ergebnisse dieses Projektes zeigen, dass (i) die Lyssavirus-Replikation relativ unabhängig von direkt bindenden Zellproteinen ist (ii) eine Interaktion von lyssaviralen Proteinkomplexen mit ASS1 antivirale oder immunmodulatorische Reaktionsmuster beeinflussen könnte und (iii) unterschiedliche Funktionalitäten von RABV und EBLV-1 Proteinen auf Ebene der viralen Hüllproteine M und G zu finden sind. Die Erkenntnisse tragen wesentlich zum besseren Verständnis der Lyssavirus Replikation bei und bieten eine wichtige Grundlage für die weiterführende Erforschung wirtsabhängiger und unabhängiger Determinanten der Virusreplikation.
Publications
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(2010). Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and intergenotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of virology 155, 1631-1641
Orbanz, J. & Finke, S.
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(2010). Intergenotypic replacement of lyssavirus matrix proteins demonstrates the role of lyssavirus M proteins in intracellular virus accumulation. Journal of virology 84, 1816-1827
Finke, S., Granzow, H., Hurst, J., Pollin, R. & Mettenleiter, T. C.
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(2012). Chimeric rabies viruses for trans-species comparison of lyssavirus glycoprotein ectodomain functions in virus replication and pathogenesis. Berliner und Munchener tierarztliche Wochenschrift 125, 219-227
Genz, B., Nolden, T., Negatsch, A., Teifke, J. P., Conzelmann, K. K. & Finke, S.
