Transdifferentiation of mouse adult spermatogonial stem cells into functional myocardium
Final Report Abstract
Die stammzell-basierte Therapie stellt einen aussichtsreichen Ansatz für die Behandlung von Herzversagen dar. Die ideale Stammzelle für die Herzmuskelregeneration konnte allerdings noch nicht definiert werden. Die von uns aus adulten Maushoden identifizierten multipotenten adulten Keimbahnstammzellen (maGSCs) zeigen ähnliche Charakteristika wie embryonale Stammzellen (ESCs). Ziel dieses Projektes war es, aus maGSC-Kulturen Flk1+ kardiale Vorläuferzellen und Kardiomyozyten zu isolieren und deren Schicksal nach Transplantation in ein Mäuseherz mit Infarkt zu verfolgen. Um reine Kardiomyozyten-Kulturen zu erhalten, sollte ein Selektionstransgen verwendet werden, wobei der transgene Reporter zur Identifikation der Donor-Zellen in vitro und in vivo dient. Die spermatogonialen Stammzellen (SSCs) wurden aus den Hoden von MHC-nLAC/MHC- neo und MHC-Neo/MHC-EGFP doppelt transgenen Mäusen isoliert und kultiviert. Jedoch war es uns nicht gelungen, SSCs von adulten DBA-Mäusen allein unter Kulturbedingungen in den pluripotenten Zustand zu überführen. Epigenetische Analysen der SSC-Kultur wiesen eine Semimethylierung des Oct4-Promotors und eine fast 100%-ige Methylierung des Nanog-Promotors auf. Wir konnten zeigen, dass SSCs (NE4-Zellen) allein durch Überexpression von Oct4 in pluripotente Stammzellen (NE4O1-Zellen) überführt werden können. Die NE4O1-Zellen sind pluripotent und besitzen die Fähigkeit, sich sowohl in vitro als auch in vivo spontan in Zellen aller drei Keimblätter zu differenzieren. Wir konnten zeigen, dass NE4O1-Zellen mittels der „Embryoid bodies“-Methode spontan zu Kardiomyozyten differenzieren können. Durch Zugabe von Geneticin wurden GFP+ Kardiomyozyten selektiert, welche die herzmuskelspezifischen Marker α-Actinin und cTnT exprimierten. Mittels Patch-Clamp-Technik wurden verschiedene Subgruppen von Kardiomyozyten, wie z.B. Vorhof-, Ventrikel-, Schrittmacher-, und Purkinje-Zellen, unterschieden. Weiterhin konnten die NE4O1-Zellen mittels Cokultivierung auf OP9-Zellen in Flk1+ Zellen (ca. 33%) differenziert werden. Anschließend konnten die Flk1+ Zellen weiter in cTnT und MF20 positive Kardiomyozyten differenziert werden. Zur Analyse des therapeutischen Effekts der Flk1+ Zellen und der GFP+ Kardiomyozyten, wurden diese Zellen in das Mausmyokardinfarktmodell injiziert. Ursprünglich wollten wir die nicht-transgene F1-Generation von DBA/C3H weiblichen Mäusen als Empfänger für die Zellinjektion verwenden. Allerdings hatten wir technische Schwierigkeiten, eine ausreichende Anzahl an F1-Mäusen zu erhalten. Daher haben wir weibliche C57BL/6J-Wildtypmäuse, denen täglich das Immunsuppressivum Ciclosporin A injiziert wurden, als Empfänger verwendet. Die Injektion der Flk1+ Zellen zeigte keinen Einfluss auf das Ausmaß des infarzierten Gewebes. Allerdings war ein rückgängiger Trend des Fibrosegrades von Tag 28 (45%) zu Tag 56 (35%) und eine signifikante Steigerung der Ejektionsfraktion und der Verkürzungsfraktion am Tag 56 zu beobachten. Zusätzlich haben wir herausgefunden, dass pluripotente Stammzellen nicht gegen eine T-Lymphozyten-vermittelte Zytotoxizität in vitro geschützt waren, und dass NK-Zellen bei der Überlebensrate von tumorerzeugenden Stammzellen im Herzen eine Rolle spielten. Weiterhin zeigten unser Daten, dass GFP+ Kardiomyozyten in vivo in das Host-Myokard integrieren. Eine elektrische Kopplung konnte erstmalig mittels 2-Photonenmikroskopie nachgewiesen werden. Es wurden keine signifikanten Unterschiede der elektrischen Integration zwischen NE4O1- und ESC-abgeleiteter Kardiomyozyten beobachtet. Diese Daten weisen darauf hin, dass die funktionelle Integration der Kardiomyozyten nicht von der Art der pluripotenten Stammzellen abhängt. Das Projekt stellt die Basis für die zukünftige Isolation von SSC-ähnlichen Stammzellen aus menschlichen Hodenbiopsien dar, die eine potentielle autologe Quelle für die Entwicklung von Behandlungsstrategien für Patienten mit Herzversagen darstellen.
Publications
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(See online at https://doi.org/10.1159/000332910) - Human spermatogonial stem cells: a novel therapeutic hope for heart regeneration and repair? Future Cardiol. 2012, 8(1)39-51
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