Identifizierung von Substraten der Proteinkinase C epsilon und Untersuchung ihrer Funktionen im Prozeß der Schmerzsensitivierung
Final Report Abstract
Die Proteinkinase C epsilon (PKCe) ist in eine Reihe von zellulären Phänomenen involviert. Während einige intrazelluäre Signalwege zur Aktivierung von PKCe bekannt sind, ist die Anzahl an identifizierten Kinasesubstraten überschaubar und erklärt nicht die unterschiedlichen zellulären Reaktionen auf die Aktivierung von PKCe. In dem durchgeführten Projekt haben wir nun neue Substrate von PKCe u.a. durch einen breiten Kinasesubstratscreen identifiziert. Die funktionelle Analyse der neu identifizierten Substratkandidaten zeigte, daß PKCe vor allem Proteine der Translationsmaschinerie sowie der Zytoskelettregulation phosphoryliert. Beide Funktionen waren bislang nicht bzw. nur indirekt in der Literatur für PKCe beschrieben. Wir konnten nun zeigen, daß PKCe und seine intrazellulären Rezeptoren, RACK1 und RACK2, zu subzellulären Regionen der Translationsregulation, den „Stress Granules" und „P-Bodies", rekrutiert werden und dort kolokalisieren. Dies ist ein breites zelluläres Phänomen und konnte in unterschieldichen Zelllinien beobachtet werden. PKCe knock-down steigert die Zellstress-induzierte Bildung von „Stress Granules" und „P-Bodies". PKC-Inhibitoren steigern die „Stress Granule" Bildung, nicht aber die „P-Body" Bildung. PKCe knock-down resultiert in einem Rückgang der ProteinTranslation. Wir konnten auch die Regulation des Zytoskeletts molekular, zellbiologisch und verhaltensbiologisch zeigen. In Silico Modellierung der TRPVl-Mikrotubuli Interaktion suggerierte, daß die PKCe Phosphorylierung von TRPV1 die Interaktion stören würde. Dies konnten wir umfangreich biochemisch nachweisen. Die Interaktionsstörung führte zu einer umfangreichen Destabilisierung der Mikrotubuli. Aktivierung von PKCe in Zellen reduzierte so die Anzahl von Mikrotubuli-enthaltenden Filopodia, zu PKCe und TRPV1-S800 abhängigen Destabilisierung von Mikrotubuli. Diese Destablisierung war unabhängig von der möglichen Kanalöffnung von TRPV1 und zeigt so einen ersten kanalunabhängigen Effekt von TRPV1. Und nicht zuletzt, die Unterbrechung der TRPV1-Mikrotubuli Interaktion durch Knock-down von TRPV1 im Tier führte dazu, daß das stark schmerzinduzierende Krebstherapeutikum, Taxol, nicht mehr schmerzsensitivierend sondern Schmerzsensitivierung blockierend wirkte. Wir haben somit zwei vollständig neue Funktionen von PKCe gezeigt: die Regulation der Proteintranslation sowie der TRPV1-abhängigen Mikrotubuli Stabilisierung und Schmerzsensitivierung.
Publications
- Estrogen destabilizes microtubules through an ion-conductivity-independent TRPV1 pathway. J Neurochem. 2011 Jun;117(6):995-1008
Goswami C, Kuhn J, Dina OA, Fernandez-Ballester G, Levine JD, Ferrer-Montiel A, Hucho T
