Regulation and Function of Ligand Binding Sites in Talin
Final Report Abstract
In diesem Projekt wurden die strukturellen, biochemischen und zellbiologischen Voraussetzungen der Wechselwirkung verschiedener Bindungspartner mit dem C-Terminus des zytoskelettalen Adaptor-Proteins Talin untersucht. Die Talin-Schwanzdomäne, insbesondere der mit TalinC bezeichnete C-terminale Abschnitt, leistet einen zentralen Beitrag zur Anbindung des Aktin-Zytoskeletts in Zellkontakten, so dass eine Inaktivierung der Bindung von TalinC an β-Integrin oder an Aktinfilamente zum Funktionsverlust des Gesamtproteins führen. Unser Ansatz beschäftigte sich zunächst mit der biochemisch-strukturellen Charakterisierung und der Prüfung der Aktivität und Zugänglichkeit von Bindungsstellen für Vinculin (VBS), β-Integrin (IBS) und Aktinfilamente (ABS) unter Verwendung von Talin-Domänenkonstrukten, welche die Helixbündel-Struktur von TalinC bestehend aus drei antiparallelen 5-Helixbündeln, IBS-2A, IBS2B und ABS-3, sowie der Dimerisierungsstelle (DS) respektieren. Für die Bindung von Vinculin haben wir nachgewiesen, dass eine Wechselwirkung mit VBS-Helices der Aktin-Bindungsstelle ABS-3/DS konstitutiv erfolgt und dies keine beobachtbaren Auswirkungen auf die Aktinfilament-Bindung hat. Die Vinculin-Bindung an die Integrin-Bindungsstelle IBS-2A/B insbesondere die VBS-Helix H50 ist hingegen durch die kompakte Faltung der Helixbündel inhibiert. Helix H50 ist wichtig für die β-Integrin-Bindung und wird erst nach konformationeller Aktivierung der Bindungsstelle zugänglich. Dadurch entsteht eine Kompetition zwischen β-Integrin und der Vinculin-Kopfdomäne um die Bindung an diese Helix. Für die Integrin-Bindung durch TalinC konnten wir zeigen, dass neben Helix H50 das gesamte IBS- 2A/B-Doppelbündel an der Interaktion beteiligt ist und die Bindung über elektrostatische Wechselwirkungen mit einem konservierten, membran-proximalen Peptid der β-Integrine erfolgt. Die Aktinfilament-Bindung erfordert eine Dimerisierung der ABS-3 über Helix H62 (DS), und ist ferner ohne strukturelle Aktivierung der ersten Helix H57 des ABS-3 Helixbündels sehr niedrig und in Zellen nicht zu beobachten. Für diese Aktivierung reicht die biochemisch zu beobachtende Bindungsfähigkeit an die Vinculin-Kopfdomäne nicht aus. Anhand von "Fluorescence Recovery After Photobleaching" (FRAP)-Analysen haben wir die Aufenthaltszeiten von Talin und TalinC-Konstrukten in Zellkontakten unterschiedlicher Zelltypen beobachtet und darüber Einblick in die Aktivität / Nutzung der Bindungsstellen erhalten. Mit Hilfe der FRAP-Analysen konnten wir nachweisen, dass TalinC in Zellkontakten die Bindung an β-Integrin und Aktinfilamente zugleich benötigt und verwendet. Fällt einer der beiden Liganden aus, reduziert sich die Aufenthaltszeit der entsprechenden TalinC-Konstrukte dramatisch. Dies kann dadurch erklärt werden, dass die volle Bindungsstärke nur durch strukturelle (allosterische) Aktivierung der Bindungsstellen für β-Integrin und Aktinfilamente im Zellkontakt erreicht wird, während die kompakte Bündelstruktur des TalinC-Proteins in Lösung minimale Bindungsaktivität aufweist. Wird eine starke Aktinfilament-Bindung durch Deletion der Helix H57 künstlich erzeugt, ist die Zytoskelett-Verknüpfung konstitutiv und die Zellen können die Kontaktbildung nicht mehr steuern. Die Aktivierung der Integrin-Bindung hingegen wird durch Vinculin kompetiert und führt zu einer zeitlich begrenzten Wechselwirkung von TalinC in Zellkontakten. In Vinculin-Knockout Zellen steigt auch die Verweildauer von Talin-Gesamtprotein in Zellkontakten auf das Doppelte im Vergleich zu vinculinexprimierenden Kontrollzellen. Zusammengefasst können wir nachweisen, dass in TalinC hochaffine Bindungsstellen für drei Liganden so miteinander verknüpft werden, dass ein steuerbares Modul entsteht. Die zentrale Bindungsstelle für Aktinfilamente der Talin-Schwanzdomäne ist nicht konstitutiv eingeschaltet sondern erfordert (zumindest zeitweise) eine Integrin-Wechselwirkung, die wiederum durch Vinculin kompetiert werden kann. Ähnliche wechselseitige Beziehungen zwischen verschiedenen Bindungspartnern werden auch für die Integrin-Bindung und Rezeptoraktivierung durch die Talin-Kopfdomäne beschrieben. Für die weitere Aufklärung der Regulation der Talin-Funktion in Zellkontakten wären Konformationssensoren sehr hilfreich, die selektiv bestimmte Bindungszustände sichtbar machen. Wir haben Konstrukte erstellt, die eine Konformationsänderung des TalinC beziehungsweise das Binden an β-Integrin über "Förster Resonance Energy Transfer" oder "Fluorescence Lifetime Imaging" Mikroskopie anzeigen. Diese Konstrukte können als Ausgangspunkt für die Entwicklung von Sensoren für Talin-Gesamtprotein dienen und zukünftig dabei helfen, Lokalisation und Zeitverlauf der Zytoskelett-Verknüpfung durch Talin sichtbar zu machen und funktional zu untersuchen.
Publications
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