Structural and functional analysis of the human endothelin receptor system
Zusammenfassung der Projektergebnisse
G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) steuern eine Vielzahl physiologischer Abläufe im menschlichen Organismus und gehören mit rund 50 % zu den wichtigsten Angriffspunkten heutiger Arzneimittel. Ein Beispiel mit hoher pharmakologischer Relevanz ist das humane Endothelin- (ET) System, das aus dem Endothelin A (ETA) und dem Endothelin B Rezeptor (ETB) besteht. Sie bilden die wichtigsten Modulatoren des kardiovaskulären Systems mit Einfluss auf Gefäßverengung und Blutdruckregulation. Viele bekannte Zivilisationskrankheiten wie z. B. Herzinsuffizienz, Bluthochdruck oder Diabetes sind mit endothelialer Fehlfunktion assoziiert. Im durchgeführten Projekt wurden Protokolle zur effizienten zellfreien Synthese präparativer Mengen des humanen Endothelin-A Rezeptors entwickelt. Die ausreichende Produktion qualitativ hochwertiger Proteinproben bildet die Basis zur strukturellen und funktionellen Aufklärung der Endothelin Rezeptoren. Der dokumentierte Prozess zur zellfreien Synthese komplexer Membranproteine in Extrakten aus E. coli Bakterien bietet somit eine kompetitive Option zur präparativen Produktion schwieriger Membranproteine. Die grundlegenden Strategien zur Durchführung des Projekts bildeten Kombinationen aus der gezielten und detaillierten Modifikation der direkten Translationsumgebung des ETA Rezeptors zur Optimierung der funktionellen Faltung, das systematische Screening von Detergentien und Detergentsgemischen sowie von Additiven zur Stabilisierung und Solubilisierung sowie die qualitative Analyse der hergestellten Proteinproben durch eine Reihe komplementärer Ansätze im Hinblick auf Stabilität, Homogenität und Ligandenbindungs-Kompetenz. Die im Verlaufe des Projekts erzielten wesentlichen Ergebnisse sind: (I) Etablierung zellfreier Expressionprotokolle zur routinemäßigen Synthese von etwa 2 Milligramm ETA Rezeptor pro Millilitern Reaktionsansatz. (II) Identifizierung des Polyoxyethylen-Alkyl- Ethers Brij 35 als geeignetes Detergenz zur Thermostabilisierung des ETA Rezeptors. (III) Analyse von ETA Proben durch Festkörper-Kernmagnetische Resonanz und Nachweis der alpha-helikalen Faltung von im P-CF Verfahren generierten Proben. (IV) Etablierung von komplementären in vitro Analysen zur Evaluierung der Homogenität von zellfrei produzierten Proben von Membranproteinen mittles Größenausschlusschromatographie, nativer und denaturierender Gelelektrophorese, Massenspektrometrie sowie. Vielwinkel-Lichtstreuung. (V) Charakterisierung der Oligomerisierung des ETA Rezeptors durch Modulierung des Mizellenmillieus sowie durch Ko-Expression und anschließenden Komplexanalysen unter Einbezug hergestellter Sets fragmentierter Derivate. (VI) Charakterisierung der Ligandenbindungs-Kompetenz des ETA Rezeptors durch Affinitätschromatographie und Fluoreszenz-Anisotropie. Hierbei konnte ein effizientes Protokoll für die Reinigung Liganden-gebundener Rezeptorfraktionen für z.B. Kristallisationsanalysen mit Bindungseffizienzen von bis zu 50 % erstellt werden. Unter optimalen Bedingungen ergeben sich somit Ausbeuten an funktionellem Rezeptor von 0.5 mg/mL zellfreiem Reaktionsansatz. Bindungsexperimente mit Radioliganden führten weiterhin zur Bestimmung der Gleichgewichtsdissoziations-konstanten (KD) und der inhibitorischen Konzentrationen (IC50) des natürlichen Liganden Endothelin 1. Die Arbeit bietet eine grundlegende Richtlinie zur Qualitätsoptimierung zellfrei synthetisierter Membranproteine und sie stellt zudem ein Orientierungshilfe zur Prozessentwicklung individueller Expressionsprotokolle dar. Die präparative Produktion hochwertiger Proben an ETA Rezeptor resultierte in die Durchführung umfassender Kristallisationsanalysen als Basis für nachfolgende Arbeiten zur Strukturbestimmung. Die erarbeiteten Resultate bieten eine fundierte Grundlage und Perspektive für weiterführende Untersuchungen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2007) Preparative scale expression of membrane proteins in E. coli based continuous exchange cell-free systems. Nat. Protocols, 2, 2945-57
Schwarz, D., Junge, F., Durst, F., Frölich, N., Schneider, B., Reckel, S., Sobhanifar, S., Dötsch, V., and Bernhard, F.
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(2007). Functional analysis of cell-free-produced human endothelin B receptor reveals transmembrane segment 1 as an essential area for ET-1 binding and homodimer formation. FEBS J., 274, 3257-69
Klammt, C., Srivastava, A., Eifler, N., Junge, F., Beyermann, M., Schwarz, D., Michel, H., Dötsch, V., and Bernhard, F.
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(2008) Large scale production of functional membrane proteins. Cell. Mol. Life Sci., 65, 1729-55
Junge, F., Schneider, B., Reckel, S., Schwarz, D., Dötsch, V. and Bernhard, F.
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(2008) Transmembrane segment enhanced labeling as a tool for the backbone assignment of a-helical membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 8262-7
Reckel, S., Sobhanifar, S., Schneider, B., Junge, F., Schwarz, D., Durst, F., Löhr, F., Güntert, P., Bernhard, F. and Dötsch, V.
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(2010) Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology 28, 262-71
Junge, F., Haberstock, S., Roos, C., Stefer, S., Proverbio, D., Dötsch, V., and Bernhard, F.
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(2010) Cell-free expression and stable isotope labelling strategies for membrane proteins. J. BioMol. NMR 46, 33-43
Sobhanifar, S., Reckel, S., Junge, F., Schwarz, D., Kai, L., Karbyshev, M., Löhr, F., Bernhard, F., and Dötsch, V.
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(2010) Membrane protein expression in cell-free systems. Methods in Molecular Biology, 601, 165-86
Schneider, B., Junge, F., Shirokov, V.A., Durst, F., Schwarz, D., Dötsch, V., and Bernhard, F.
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(2010) Modulation of G-protein coupled receptor sample quality by modified cell-free expression protocols: A case study of the human endothelin A receptor. J. Struct. Biol., 172, 94-106
Junge, F., Luh, L.M., Proverbio, D., Schäfer, B., Abele, R., Beyermann, M., Dötsch, V., and Bernhard, F.
