Konfokales Laserscanning-Mikroskop
Final Report Abstract
Die federführende Arbeitsgruppe hat sich im Rahmen des von der Canadian Foundation for Innovation geförderten New Opportunities Projektes "Genetically encoded, fluorescent nitric oxide receptors, modulators and sensors" das Ziel gesetzt mit Hilfe von fluoreszierenden Fusionsproteinen Arzneimittelmechanismen und entscheidende Komponenten der Signaltransduktion durch das gasförmige Signalmolekül Stickstoffmonoxid (NO) zu studieren. Mit Hilfe von Fluoreszenzresonanz-Energie-Transferexperimenten basierend auf Fluoreszenzlebensdauermessungen konnte die strukturelle Organisation der NO-sensitiven Guanylyl Cyclase näher charakterisiert werden. Die hierdurch erzielten Erkenntnisse führten zur Konstruktion von Fusionsproteinen zwischen den beiden unterschiedlichen Untereinheiten. Diese weisen wesentliche technische Vorteile als Modulatoren und Sensoren auf. Darüber hinaus konnten basierend auf diesen monomeren Enzymkomplexen durch weitere Fusion mit einem konformationell destabilisierten grün fluoreszierenden Protein isoformenspezifische Sensoren für NO konstruiert werden, die den natürlicherweise vorkommenden Formen der NO-sensitiven Guanylyl Cyclasen entsprechen. Insbesondere bei diesen Experimenten hat sich das System zur Regulierung der Laseranregungsintensität in Abhängigkeit der detektierten Emission (CLEM) bewährt, um dem Problem des sogenannten Ausbleichens entgegenzutreten. Im Rahmen des DFG-Projektes „Bedeutung der Hämoxygenasen für den Stickstoffmonoxid cGMP Signalweg" konnte gezeigt werden, dass die Translokation der Hämoxygenase 1 bei Hypoxie vom endoplasmatischen Retikulum zum Kern durch Interaktion mit der NADPH cytochrome P450 reduktase verhindert wird. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Spleißvariante der a1 Untereinheit der NO sensitiven Guanylyl Cyclase mit der Hämoxygenase 1 am endoplasmatischen Retikulum kolokalisiert. Durch Verwendung des Redoxsensors Grx1-roGFP2 konnte gezeigt werden, dass die Spleißvariante wie bei dieser Lokalisation zu erwarten in einem stärker oxidierenden Milieu lokalisiert ist als die klassiche a1 Untereinheit. Am Institut für Pharmazeutische Technologie werden dreidimensionalen organotypischen Haut- und Corneaäquivalenten als in vitro Modelle kultiviert. Mit Hilfe des konfokalen Lasermikroskopes werden diese Modelle insbesondere im Hinblick auf die Expression von Arzneimitteltransportern näher charakterisiert. Die Zellkulturmodelle dienen der Vermeidung von Tierversuchen und sind einsetzbar als Permeationsbarriere vergleichend oder alternativ zur exzidierten Humanhaut oder humaner Cornea. Darüber hinaus werden der Einfluss und die Lokalisation von nanoskaligen Arzneistoff-Trägersysteme in Zellkulturmodellen mit Hilfe des konfokalen Lasermikroskops untersucht. In Kooperation mit dem Institut für Pharmazeutische Chemie und einem Industriepartner ging es um das Design und die Charakterisierung von Hemmstoffe von Proteinkinasen, die eine Eigenfluoreszenz aufweisen und zur Therapie von malignen Tumoren entwickelt werden. Mit Hilfe des konfokalen Lasermikroskops konnte die Lokalisierung der Wirkstoffe in Tumorzellen untersucht werden. Darüber hinaus wird zur Zeit der Einfluss von neuen Tumortherapeutika auf den mitochondrialen und cytosolischen Redoxzustand gemessen, der durch ratiometrische Messung der Sonden Grx1-roGFP2 und mito-Grx1-roGFP2 bestimmt wird. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anschaffung des beantragten Gerätes die lebenswissenschaftlich ausgerichtete Forschung im Bereich der Pharmazie komplementiert und die Vernetzung in der Fakultät für Lebenswissenschaften entscheidend gestärkt hat.
Publications
- Fluorescent fusion proteins of soluble guanylyl cyclase indicate proximity of the heme nitric oxide domain and catalytic domain. PLoS One. 2010 Jul 15;5(7):e11617
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- Bidirectional insulin granule turnover in the submembrane space during K(+) depolarization-induced secretion. Traffic 2011; 12:1166-78
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- Synthesis and structure of fluorescent chelate boron complexes of 4-anilinomethylidene-1-benzazepine-2,5-dione ligands. Synthesis 2011, 2848-2858
Tolle, N., Dunkel, U., Oehninger, L, Ott, I., Preu, L., Haase, T., Behrends, S., Jones, P. G., Totzke, F., Schächtele, C., Kubbutat, M. H. G., Kunick, C.
- The amino-terminus of nitric oxide sensitive guanylyl cyclase α₁ does not affect dimerization but influences subcellular localization. PLoS One. 2011;6(9):e25772
Kraehling JR, Busker M, Haase T, Haase N, Koglin M, Linnenbaum M, Behrends S
