Localization and intracellular trafficking of the chemokine receptor CCR7 after ligand mediated signal transduction and chemotaxis
Final Report Abstract
Für die Stimulierung einer T Lymphozytenantwort gegen Pathogene ist es erforderlich, dass diese von dendritischen Zellen (DC) in der Peripherie aufgenommen werden und entlang von Lymphgefässen in die T Zellzone der drainierenden Lymphknoten einwandern. Dort treffen sie auf rezirkulierende naive T Zellen, die ihren Weg aus den Blutgefässen ebenfalls in die T Zellzone der Lymphknoten finden. Die Wanderung sowohl von DC als auch von naiven T Zellen in die T Zellzone ist gesteuert von den Chemokinen CCL19 und CCL21, die von Stromazellen im Lymphknoten produziert werden, und die an den Chemokinrezeptor CCR7 auf DC und T Zellen binden. Wie die Signale nach Chemokinbindung an CCR7 in den Zellkern weitergeleitet werden und wie die Endozytose und intrazelluläre Wanderung des Rezeptors gesteuert ist, war zu Beginn dieses Projektes kaum verstanden. Vor Beginn dieses Projektes hatten wir allerdings zeigen können, dass CCR7 nach Bindung von CCL19 internalisiert und recycelt wird, während CCL19 in Lysosomen abgebaut wird. Ausserdem konnten wir zeigen, dass CCR7 konstitutiv poly-ubiquityliert wird. In diesem Projekt haben wir nun untersucht, welche Funktion die konstitutive Polyubiquitylierung von CCR7 für die intrazelluläre Wanderung und Signaltransduktion von CCR7 hat. Zu diesem Zweck haben wir Transfektanten generiert, die Wildtyp CCR7 und eine 7K7R Mutante von CCR7 exprimieren. In der CCR7-7K7R Variante wurden alle sieben Lysine (K) im Zytoplasma durch Arginine (R) ersetzt, so dass keine Ubiquitylierung mehr stattfand. Wir konnten zeigen, dass zwar CCR7-7K7R nach CCL19 Stimulierung normal endozytiert wird, die Rückkehr an die Zelloberfläche war hingegen stark reduziert. Die Rezyklierung von CCR7 verläuft über frühe Endosomen und das trans Golgi Netzwerk, in welchem die 7K7R Variante, nicht aber Wildtyp CCR7 akkumulierte. Einen Effekt der Poly-ubiquitylierung von CCR7 auf dessen Abbau konnten wir hingegen nicht feststellen. Allerdings war die CCL19/21 stimulierte Wanderung der CCR7-7K7R Transfektante im Vergleich zur CCR7 Wildtyptransfektante reduziert. CCR7 ist ein G-Protein gekoppelter Rezeptor, der die Plasmamembran siebenmal durchspannt. An seinem C-Terminus befindet sich eine 46 Aminosäuren lange Sequenz. Um die Bedeutung dieser Sequenz für die Signaltransduktion und die intrazelluläre Wanderung von CCR7 zu erforschen, haben wir drei Deletionsvarianten von CCR7 in stabilen Transfektanten exprimiert, in denen der zytoplasmatische C-Terminus von CCR7 ganz oder teilweise fehlte. Ausserdem haben wir eine CCR7 Transfektante generiert, in welcher das DRY Motiv von CCR7 zu DNY mutiert wurde. Alle diese CCR7 Mutanten wurden an der Zelloberfläche exprimiert und konnten CCL19 binden. Wir konnten zeigen, dass die letzten 43 Aminosäuren von CCR7 und das DRY Motiv benötigt werden für die Wanderung nach CCL19 und CCL21, für die intrazelluläre Calziummobilisierung, für die Phosphorylierung von Erk-1/2, und für die Aktivierung von G-Proteinen. Die Endozytose und die Rezyklierung von CCR7 war in diesen Mutanten hingegen normal. Bei der Untersuchung der Signaltransduktion von CCR7 in menschlichen T Lymphozyten haben wir (eher zufällig) gefunden, dass die vorherige kurze Stimulierung der T Zellen über den T- Zellrezeptor bei einer nachfolgenden Stimulierung von CCR7 zu einer verbesserten Wanderung der T Zellen führt. Bei diesem ‚cross-talk’ zwischen T Zellrezeptor und CCR7 spielen Kinasen der Src Familie und LAT eine entscheidende Rolle. Da CCR7 für die Stimulierung von zellulären Immunantworten gegen Viren oder Bakterien aber auch für die Metastasenbildung von Tumorzellen eine wichtige Rolle spielt, können die Erkenntnisse dieser Arbeit über die Signaltransduktion und Funktion von CCR7 Anhaltspunkte für die Entwicklung von Wirkstoffen zur immunsuppessiven Therapie oder zur Unterdrückung von Metastasenbildung von Tumoren geben.
Publications
- 2008. Distinct motifs in the chemokine receptor CCR7 regulate signal transduction, receptor trafficking and chemotaxis. J. Cell Sci. 121: 2759-2767
Otero, C., P. S. Eisele, K. Schaeuble, M. Groettrup, and D. F. Legler
- 2011. Cross-talk between TCR and CCR7 signaling sets a temporal threshold for enhanced T lymphocyte migration. J. Immunol. 187: 5645-52
Schaeuble, K., M. A. Hauser, E. Singer, M. Groettrup, and D. F. Legler
- 2012. Ubiquitylation of the chemokine receptor CCR7 enables efficient receptor recycling and cell migration. J. Cell Sci. 125: 4463-4474
Schaeuble, K., M. A. Hauser, A. V. Rippl, R. Bruderer, C. Otero, M. Groettrup, and D. Legler
(See online at https://doi.org/10.1242/jcs.097519)
