Amino sugar-specific delta13C analysis for determining the formation and use of microbial residues
Final Report Abstract
Aminozucker haben als Bestandteile von Zellwänden von Mikroorganismen eine große Bedeutung in Böden, wo sie als Indikatoren für die mikrobielle Residualmasse fungieren, da sie sich im Humus anreichern. Eine besondere Gewichtung kommt dabei den Aminozuckern Glucosamin und Muraminsäure zu. Diese Aminozucker sind spezifisch für die beiden Hauptgruppen von Bodenmikroorganismen. So kommt Muraminsäure ausschließlich in der bakteriellen Zellwand und Glucosamin kommt hauptsächlich in der pilzlichen Zellwand vor. Um Tracerexperimente im Bereich der natürlicheren Anreicherung zur Bestimmung des Umsatzes von mikrobiellen Residuen durchführen, ist eine Isotopenanalyse notwendig. Ziel des Projekts war es eine aminozucker-spezifischen delta13C Methode mit hoher Genauigkeit zur Erfassung der Bildung und Nutzung von mikrobiellen Residuen in Böden- und Pflanzenmaterialien zu etablieren und anzuwenden. Zunächst wurde die Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) als Standardmethode optimiert, um einen hohen Probendurchsatz zu ermöglichen. Danach wurde als weitere Methode zur Bestimmung von Aminozuckern die Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromatographie (HPAEC) optimiert und validiert. Die Einführung der HPAEC-Methodik war erforderlich, um die Trennung mit einer kohlenstofffreien mobilen Phase durchführen zu können, was wiederum für die spätere Messung der 13C/12C-Verhältnisse mit der Isotopenverhältnis-Massenspektroskopie (IRMS) notwendig war. Nach der Kalibrierung der HPAEC-Methode wurde diese mit der RP-HPLC-Methode verglichen. Weiterhin wurden eine ganze Reihe anderer flüssigkeits-chromatographische Methoden mit kohlenstofffreien Eluenten getestet (Kationenaustausch- und Ionenausschluss-Chromatographie) in Hinblick auf eine schnellere und effizientere Trennung der Aminozucker. Zusätzlich wurden verschiedene Reinigungsmethoden zur Eliminierung von Matrixsubstanzen und zur Konzentrierung von Muraminsäure in den Probenhydrolysaten getestet. Die Konzentrierung von Muraminsäure war notwendig, da die HPLC-IRMS im Vergleich zur RP-HPLC mit Fluoreszenzdetektion eine um ca. 400fach geringere Empfindlichkeit bezüglich Muraminsäure hat. Als Reinigungsmethoden haben sich unter anderem Kationen- und Anionenaustauscherharze geeignet. Nach erfolgreicher Kalibrierung der HPAEC-IRMS wurde die neu eingeführte Methode an Boden- und Pflanzenproben getestet. Um Pflanzenproben messen zu können, war eine weitere Modifikation der HPAEC-IRMS-Methode erforderlich. Nach gelungener Optimierung dieser Methode wurde ein Pilzanzuchtversuch durchgeführt, um die Bildung und den Umsatz saprotropher Pilze zu bestimmen. Der Hintergrund des Pilzwachstumsversuchs bildeten die Fragen, welches Substrat von saprotrophen holzzersetzenden Pilzen bevorzugt abgebaut wird, worauf sich die in der Literatur beschriebene delta13C-Anreicherung in saprotrophen Pilzen während des Pilzwachstums zurückführen lässt und inwiefern kinetische Isotopenfraktionierungen bei der Inkorporation des Substrat-Kohlenstoffs eine Rolle spielen. Die Ergebnisse des Projekts wurden in folgenden 4 Artikel referiert publiziert: (1) Optimierung einer HPLC-Methode zur Aminozuckerquantifizierung in Boden- und Pflanzenhydrolysaten, (2) Vergleich von HPLC-Methoden zur Aminozuckerbestimmung in Bodenhydrolysaten. (3) Bestimmung des Umsatzes saprotropher Pilze mittels Glucosamin-spezifischer delta13C Flüssigkeitschromatographie-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (4) Kurzzeitige Veränderungen in Aminozucker spezifischen delta13C-Werten nach Zugabe von C4- und C3-Saccharose. Es zeigt sich im letzten Versuch, dass die HPAEC-IRMS-Methode geeignet ist, Aminozucker spezifische delta13C-Werte im Bereich der natürlicheren Anreicherung zu messen. Aber sie ist nicht dafür geeignet, in Kurzzeit-Inkubationen den Umsatz der mikrobiellen Residualmasse zu messen, da die Speicher von Galactosamin und Glucosamin im Humus zu groß waren, um signifikante Veränderungen in den delta13C-Werten zu messen. Die delta13C-Werte nahmen in der Reihenfolge Muraminsäure > Galactosamin > Glucosamin ab. Es wurden ähnlich delta13C-Werte im Glucosamin, in der mikrobiellen Biomasse und im Humus bestimmt. Die Gründe für die beobachteten Unterschiede in delta13C-Werten kann zurzeit noch nicht erklärt werden.
