Modulation der katalytischen Aktivität von SHP-1 und SHP-2 durch alternative Arten der Phosphopeptidbindung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die selektive Hemmung von Enzymen der intrazellulären Signalkaskaden ist ein aktuelles Ziel in der Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkeiten für zahlreiche pathophysiologische Zustände. Obwohl klassische Inhibitoren auf eine Blockierung des aktiven Zentrums abzielen und damit zweifellos die Inhibierung des entsprechenden Enzyms herbeiführen, sind sie aufgrund der Sequenz- und Strukturhomologie innerhalb bestimmter Enzymfamilien meist ausgesprochen unspezifisch und finden somit nur beschränkt Anwendung. In neueren Ansätzen wird dagegen angestrebt, Bindungsstellen außerhalb des aktiven Zentrums zu attackieren, die z.B. auf Proteinmodulen in der Nähe der katalytischen Domäne zu finden sind. Die SH2-Domänen der Proteintyrosinphosphatase SHP-1, insbesondere die Nterminale SH2-Domäne, sind aufgrund ihrer Beteiligung an der allosterischen Regulation der Enzymaktivität in besonderem Maße für die Entwicklung von Effektoren interessant. Ziel des Projektes war es deshalb, über die Kenntnis der minimalen Konsensussequenzen hinaus eine detailierte Analyse der topographischen und konformationellen Erfordernisse zur spezifischen Bindung an die SHP-1 N-SH2-Domäne vorzunehmen und davon ausgehend Konzepte für die gezielte Modulation der Phosphataseaktivität zu erarbeiten. Die Strategien zur Regulation der Phosphatase wurden aufgrund der Domänenstruktur des Enzyms abgeleitet, da diese verschiedene Möglichkeiten des Angriffs durch niedermolekulare Verbindungen bietet. Neben einer detailierten. Analyse der Determinanten zur hochaffinen Bindung an N-SH2 sowie zur Aktivierung bzw. Inhibierung von SHP-1 konnte ein wichtiger Beitrag zur Klärung der Frage nach der Bedeutung der Aminosäurereste C-terminal der minimalen Konsensussequenz geleistet werden. Letzteres war essentiell für die noch andauernden Untersuchungen bivalenter Liganden, die neben der SH2-Erkennungssequenz ein weiteres Motiv enthalten, dass zur Interaktion mit einer unabhängigen Bindungsstelle in der Nähe der N-SH2/PTP-Kontaktfläche vorgesehen ist. Im Bezug auf substratanaloge Verbindungen konnte anhand von kinetischen Untersuchungen gezeigt werden, dass bestimmte Motive mit drei phosphorylierten Tyrosinresten gegenüber mono- oder biphosphorylierten Sequenzen bevorzugt durch SHP-1 umgesetzt werden. Die Kenntnis der Lokalisierung der Phosphotyrosinreste und der strukturellen Eigenschaften der weiteren Aminosäuren innerhalb dieses Motivs beeinflußt folglich das Design von Effektoren der katalytischen Domäne. Die aus unseren Untersuchungen gewonnenen Informationen sind für die weitere Entwicklung spezifischer Inhibitoren der Proteintyrosinphosphatase SHP-1 wesentlich, da die Präferenzen der molekularen Erkennung von SH2-Liganden sowie von Substraten präzisiert werden konnte. Im Hinblick auf die Intervention der SH2-Domänen- Interaktionen kann die Sequenz- undStrukturhomologie zur verwandten SHP-2 limitierend sein, obwohl SHP-1 seine N-SH2-Liganden spezifischer erkennt als SHP-2. Aus unserer Sicht sollte eine solche Unterscheidung zwischen beiden Phosphatasen auf der Ebene der C-terminal verlängerten Konsensussequenzen (>pY+3) dennoch möglich sein. Eine Kopplung von hochspezifischen SH2-Liganden mit substratanalogen Motiven bzw. mit den vorgeschlagenen Motiven, die nicht im aktiven Zentrum binden, ist deshalb Gegenstand aktueller Untersuchungen. Studien an hochspezifischen peptidischen Verbindungen erleichtern perspektivisch das rationale Design von niedermolekularen Effektoren für SHP-1.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Konformationelle Erfordernisse für die Bindung an SHP-1 N-SH2 (Strategien a-d): Hampel, K., Kaufhold, I., Zacharias, M., Böhmer, F. D., Imhof, D., Phosphopeptide ligands of the SHP-1 N-SH2 domain: Effects on binding and stimulation of phosphatase activity. ChemMedChem 2006, 1, 869-877.
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Relevanz der Spezifität C-terminal von pY+3. Modellierung (Strategie c): Imhof, D.,* Wavreille, A.-S.,* May, A., Zacharias, M., Tridandapani, S., Fei, D., Sequence specificity of SHP-1 and SHP-2 SH2 domains: Critical roles of residues beyond the pY+3 position. J. Biol. Chem. 2006, 281, 20271-20282.
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Teichmann, K., Hampel, K., Kaufhold, I., Zacharias, M., Böhmer, F.D., Imhof, D., SH2 domain directed effectors of SHP-1 phosphatase activity; In Peptides 2006, Proceedings of the 29th European Peptide Symposium, (Rolka, K., Rekowski, P., and Silberring, J., eds.), Kenes International, Geneva, 308-309.
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Vorarbeiten Strategie d (Substratspezifität): Teichmann, K., Winkler, R., Hampel, K., Trümpier, A., Böhmer,. F. D., Imhof, D., Dephosphorylation of a multisite phosphorylated segment from receptor tyrosine kinase Ros by SHP-1 and PTPIB. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2007, 853, 204- 213.
