Metabolische Optimierung von Escherichia coli zur de-novo Synthese von 2‘-Fucosyl-Lactose aus Glycerin und Lactose im Zulaufverfahren

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professorin Dr. Kathrin Castiglione; Professor Dr. Sebastian Aljoscha Wahl; Professor Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz
• Fachliche Zuordnung: Bioverfahrenstechnik
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 545517165

Humane Milch-Oligosaccharide kommen in großer Menge in Muttermilch vor. Das Trisaccharid 2‘-Fucosyl-Lactose (2′-FL) ist eines der häufigsten Oligosaccharide und für die Verwendung in Säuglingsnahrung zugelassen. Da die chemische Herstellung ineffizient ist, werden biosynthetische Routen favorisiert – insbesondere Ganzzell-Synthesen mit rekombinanten Escherichia coli. Bei der de novo-Synthese wird Mannose-6-Phosphat in vier enzymatischen Schritten zu GDP-L-Fucose umgesetzt und dann von einer α-1,2-Fucosyltransferase für die Fucosylierung von Lactose genutzt. Heute sind entsprechend metabolisch gestaltete E. coli Produktionsstämme verfügbar, die eine Herstellung von 2‘-FL mit Glycerin als Energie- und Kohlenstoffquelle und Lactose als Precursor im Zulaufverfahren ermöglichen. Um zum einen ein besseres Verständnis für die Synthese von 2‘-FL mit rekombinanten E. coli im Zulaufverfahren gewinnen und zum anderen diese Erkenntnisse für eine weitere metabolische Optimierung des Stoffwechselnetzwerks nutzen zu können, sollen zunächst die limitierenden Schritte im Stoffwechsel von 2‘-FL-Produzenten im Zulaufverfahren identifiziert werden. Hierzu sollen Kurzzeitanalysen (Metabolom, Fluxom) von E. coli Zellen aus dem Zulaufverfahren nach schnellen Medienwechseln und nachfolgender metabolischer Kontrollanalyse (MCA) genutzt werden. Die aus der MCA abgeleiteten Ziele für genetische Veränderungen werden im 2′-FL-Produktionsstamm umgesetzt (Überexpression von Genen limitierender Enzyme, Expression von Genen deregulierter und optimierter Enzyme oder Deletion von Genen zur Reduktion unerwünschter Kohlenstoffflüsse). Eine Hypothese basierend auf den bisherigen Erkenntnissen ist, dass eine niedrige α-1,2-Fucosyltransferase-Aktivität höchst wahrscheinlich einen der limitierenden Faktoren in der 2‘-FL-Synthese darstellt. Hierfür sind zwei Eigenschaften der bislang bekannten Enzyme ursächlich: eine geringe lösliche Expression in E. coli und niedrige Wechselzahlen mit dem Substrat Lactose. Daher soll eine α-1,2-Fucosyltransferase mit besserer löslicher Expression verfügbar gemacht werden. Hierbei wird ein Taxonomie-basiertes Screening nach neuen natürlichen Varianten mit dem Protein Engineering ausgewählter Enzyme kombiniert. Die Integration stabilisierender Mutationen kann anhand guter Homologiemodelle erfolgen. Modifikationen im aktiven Zentrum zur Erhöhung der Aktivität mit Lactose lassen sich am besten basierend auf einer Kristallstruktur entwickeln. Diese ist jedoch momentan für diese Enzymklasse nicht verfügbar. Die Strukturaufklärung soll mit einer Variante einer cyanobakteriellen α-1,2-Fucosyltransferase, die in Vorarbeiten schon sphärolitisches Kristallwachstum gezeigt hat, erfolgen. Verbesserte Enzyme werden in den MCA-geleiteten Prozess der Stammentwicklung eingespeist. Die Produktionsleistungen der verbesserten E. coli Stämme werden nachfolgend im optimierten Zulaufverfahren evaluiert, um eine besonders effiziente Herstellung von 2‘-FL zu ermöglichen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich: Professor Dr. Yves André Muller