Aufklärung der Funktionen des Proteasekomplexes TPPII anhand konditionaler Knockout-Mäuse
Final Report Abstract
Tripeptidylpeptidase II (TPPII) bildet mit 6 MDa die größten Proteasekomplexe eukaryotischer Zellen. Der Komplex fungiert vermutlich hauptsächlich downstream von Proteasomen. Im Rahmen des Projektes wurden konditionale TPPII-Knockout (KO)-Mäuse hergestellt. Die vorangegangene Förderperiode zeigte, dass ein generalisierter TPPII-KO, hergestellt durch das Kreuzen von TPPIIfl/fl- Mäusen mit CMV-Cre-Mäusen, nicht letal ist. Bei der initialen Charakterisierung fiel jedoch eine prämature Immunseneszenz mit beschleunigter Thymusatrophie und progredienter Leukopenie auf. Die beobachtete Lymphopenie ging mit einer Abnahme naiver T-Zellen und einer verstärkten Apoptose und Seneszenz aktivierter (proliferierender) CD8+ T-Zellen einher. Fibroblasten zeigten auch prämature Seneszenz. Außerdem zeigte sich eine erhöhte Mortalität älterer Tiere und somit eine verkürzte Lebensspanne. Des Weiteren fanden wir Hinweise auf eine überwiegend negative Rolle von TPPII im klassischen MHC-Klasse-I-Weg und bei der MHC-Klasse-I-Kreuzpräsentation. CD8-T-Zell-Antworten auf akute LCMV-Infektionen waren bei jungen TPPII-KO-Mäusen jedoch nur geringfügig schlechter. In der letzten Förderperiode gingen wir Hinweisen auf eine Rolle von TPPII bei der zellulären Antwort auf γ-Bestrahlung nach, die es in der Literatur gab und die auf dem Einsatz von Proteaseinhibitoren, siRNA- und Überexpressionsexperimenten beruhten. In diesen Experimenten fanden wir weder Anhaltspunkte für eine strahleninduzierte Kerntranslokation von TPPII noch für eine Rolle bei der Stabilisierung von p53. Auch die Sensitivität von TPPII-KO-Mäusen gegenüber Ganzkörperbestrahlung sowie von unstimulierten TPPII-defizienten Thymozyten und Lymphozyten gegenüber γ-Bestrahlung, die normalerweise völlig von p53 abhängen, erschien unbeeinträchtigt. Allerdings zeigten aktivierte CD8+ TPPII-KO-T-Zellen deutlich verstärkte Apoptose nach Bestrahlung im Vergleich zu Wildtyp-Zellen. Durch Transformation von TPPIIfl/fl-Fibroblasten mit Myc und Ras und nachfolgender TPPII-Deletion mit einem Cre-exprimierenden Retrovirus untersuchten wir eine mögliche Rolle von TPPII in transformierten Zellen. Wir fanden jedoch auch hier nach Bestrahlung keine Abhängigkeit der p53-Funktionalität von TPPII. Auch die basale Proliferation, das basale Zellüberleben und das Zellüberleben nach Bestrahlung unterschieden sich nicht von denen in transformierten Wildtyp-Zellen. Vergleichende quantitative massenspektrometrische Untersuchungen des Proteoms von aktivierten CD8+ TPPII-Wildtyp- und -KO-T-Zellen zeigten, dass nur wenige Proteine höher, jedoch recht viele in den TPPII-KO-Zellen geringer exprimiert waren. Deutlich herabreguliert waren u.a. alle Untereinheiten des Komplexes TCP1 (TRiC) und bekannte Substrate dieses Chaperons sowie Komponenten des Glykolyseweges. Homozygote männliche TPPII-KO- Mäuse zeigten eine stark reduzierte Fertilität mit einer verringerten Zahl postmeiotischer Zellen, die außerdem eine reduzierte Motilität und veränderte Morphologie aufwiesen. Letztlich zeigte sich der Wert der TPPII-KO-Mäuse auch bei vergleichenden Untersuchungen von Maus und Mensch. Erste Patienten mit einer TPPII-Defizienz wurden erst vor kurzem identifiziert, und wir kooperierten mit klinisch tätigen Kollegen bei der Charakterisierung des immunhämatopoetischen Systems eines TPPII-defizienten Patienten, wobei sich parallel durchgeführte Analysen an TPPII-KO-Mäusen als sehr nützlich erwiesen. Neben einer erhöhten MHC-Klasse-I-Expression fanden sich sowohl bei den defizienten Mäusen als auch beim Patienten eine progrediente Leukopenie und Anzeichen von T- und B-Zell-Seneszenz, was beim Patienten mit einer Autoimmunität in Form von autoimmunhämolytischen Cytopenien und einer erhöhten Infektanfälligkeit assoziiert ist.
Publications
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2009. Tripeptidyl peptidase II plays a role in the radiation response of selected primary cell types but not based on nuclear translocation and p53 stabilization. Cancer Res 69:3325–3331
Firat, E., C. Tsurumi, S. Gaedicke, J. Huai, and G. Niedermann
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2009. Viability and DNA damage responses of TPPII-deficient Myc- and Ras-transformed fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun 386:563–568
Tsurumi, C., E. Firat, S. Gaedicke, J. Huai, P. K. Mandal, and G. Niedermann
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2015. Early-onset Evans syndrome, immunodeficiency, and premature immunosenescence associated with tripeptidylpeptidase II deficiency. Blood 125:753–761
Stepensky, P., A. Rensing-Ehl, R. Gather, S. Revel-Vilk, U. Fischer, S. Nabhani, F. Beier, T. H. Brummendorf, S. Fuchs, S. Zenke, E. Firat, V. M. Pessach, A. Borkhardt, M. Rakhmanov, B. Keller, K. Warnatz, H. Eibel, G. Niedermann, O. Elpeleg, and S. Ehl
