Structural Enzymology of Hydroxylation Reactions on Aromatic Compounds
Final Report Abstract
In diesem Projekt wurden die katalytischen Strategien zweier Flavoenzyme untersucht. Wir waren dabei besonders daran interessiert wie die Flavoenzyme ihre Aktivität regulieren können. Im ersten Projektteil wurde eine FAD-abhängige Reduktase untersucht, die zwei Reduktionsäquivalente von NADH aufnimmt und einzeln an [FeS]-Zentrenhaltige Proteine weitergibt. Die physiologische Funktion dieses Elektrontransfersystems ist die Nutzung der Elektronen zur Hydroxylierung aromatischer Verbindungen mit molekularen Sauerstoff an einem einkernigen Eisenzentrum einer Mono/Dioxygenase. Eine katalytische Herausforderung des Flavoproteins ist zu gewährleisten, dass die Elektronen vom reduzierten Flavin auf den physiologischen Partner, ein Rieske-Typ [2Fe2S]-Ferredoxin, transferiert und nicht auf molekularen Sauerstoff übertragen werden. Wir konnten zeigen, dass die Ausbildung eines stabilen Ladungstransfer-Komplexes zwischen dem reduzierten Enzymen und NAD+ die reaktive C4a-Position des Isoalloxazinrings abschirmt, den Ring in eine untypische planare Konformation drängt und dadurch die Aktivität des reduzierten Flavins mit Sauerstoff deutlich verringert. Im zweiten Projektteil wurde ein Flavoenzym untersucht, das NADH und NADPH als Elektronendonatoren verwenden kann und in der Lage ist vielfältige N-haltige aromatische Substrate zu reduzieren. So wirkt es z.B. im Abbauweg des carcinogenen Chinolins mit, wie er in Pseudomonas putida 86 beschrieben wurde. Eine besondere Herausforderung dieser Enzyme ist die oxidationsstufenabhängige Bindung unterschiedlicher Substrate im aktiven Zentrum. Wir konnten zeigen, dass die Redox-abhängige Konformationsänderung eines Tryptophanrestes, der im reduzierten Zustand in das aktive Zentrum hereinklappt, hilft die unproduktive Bindung von Substraten zu verhindern. Ein weiterer Regulator der Aktivität ist ein Cysteinrest im aktiven Zentrum, dessen Austausch gegen Serin das Reduktionspotenzial des FMN/FMNH-Paares deutlich erhöht, die Geschwindigkeit der reduktiven Halbreaktion ansteigen lässt und die Geschwindigkeit der oxidativen Halbreaktion deutlich vermindert. Auf diese Weise gelingt es den verschiedenen Enzymen der Old-Yellow-Enzyme Familie ihre Aktivität den verschiedenen Substraten anzupassen. Unsere Resultate zeigen neue Wege auf wie Enzyme ihre Reaktivität modellieren können und können damit für das Design neuer Bio-Katalysatoren genutzt werden.
Publications
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(2009). "Kinetic characterization of xenobiotic reductase A from Pseudomonas putida 86". Biochemistry 48(48):11412-11420
Spiegelhauer O., Dickert F., Mende S., Niks D., Hille R., Ullmann M., Dobbek H.
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(2010). "Cysteine as a modulator residue in the active site of xenobiotic reductase A: a structural, thermodynamic and kinetic study". J. Mol. Biol. 398(1):66-82
Spiegelhauer O., Mende S., Dickert F., Knauer S.H., Ullmann G.M., Dobbek H.
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(2010). "Determinants of substrate binding and protonation in the flavoenzyme xenobiotic reductase A". J. Mol. Biol. 403(2):286-298
Spiegelhauer O., Werther T., Mende S., Knauer S.H., Dobbek H.
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(2012). "Suppression of electron transfer to dioxygen by charge transfer and electron transfer complexes in the FAD-dependent reductase component of toluene dioxygenase". J. Biol. Chem. 287(45):38338-38346
Lin T.Y., Werther T., Jeoung J.H., Dobbek H.
