Small non-coding RNAs with regulatory functions in alpha-Proteobacteria: Transcriptome-based analysis of regulatory RNAs in Bradyrhizobium japonicum
Final Report Abstract
Die posttranskriptionelle Regulation auf RNA-Ebene ist von großer Bedeutung für die Anpassung von Bakterien an wechselnden Umweltbedingungen. Sie ist ein Zusammenspiel von Ribonukleasen (RNasen), RNA-Bindeproteinen und regulatorischen RNAs. In den letzten 10 Jahren ist es klar geworden, dass alle Zellen hunderte bis tausende nichtkodierende RNAs mit regulatorischem Potential besitzen, aber die Gene für diese RNAs können nicht automatisch annotiert werden. Im Rahmen dieses Projektes wurden kleine RNAs (sRNAs) in Sinorhizobium meliloti (Symbiont der Luzerne) und Bradyrhizobium japonicum (Symbiont der Sojapflanze) identifiziert und untersucht. Diese Bakterienspezies sind wichtige Modellorganismen für die Interaktion zwischen Mikroben und höheren Wirtsorgansimen. Als Stickstoff-fixierende Symbionten von Leguminosen (Rhizobien) sind sie auch von landwirtschaftlicher Bedeutung. Wir haben sRNAs in S. meliloti nachgewiesen und ihre Halbwertszeiten unter unterschiedlichen Bedingungen sowie die Abhängigkeit vom RNA-Chaperon Hfq untersucht. Dabei haben wir Beispiele von Hfq-abhängigen und Hfq-unabhängigen regulatorischen RNAs gefunden und posttranskriptionelle Regulation der sRNA-Expression demonstriert. Die Untersuchung von RNase-Mutanten, deren sRNAs anomales Gellaufverhalten aufweisen, hat gezeigt, dass zwei RNasen, RNase E und RNase J, für S-Adenosylmethionin (SAM)-Homöostase in S. melioti notwendig sind. Der Level des Hauptmethyldonors SAM ist erhöht in den Mutanten, was zu unkontrollierter Methylierung von Biomolekülen inklusive RNAs führt. Diese Erkenntnisse eröffnen die Möglichkeit der Untersuchung von SAM-Regulation und RNA-Methylierung in Rhizobien. Für B. japonicum wurde eine Analyse des primären Transkriptoms unter freilebenden und symbiotischen (in Wurzelknöllchen der Sojapflanze) Bedingungen durchgeführt, mit dem Ziel praktisch alle unter diesen Bedingungen vorhandene, nicht-annotierte Transkripte zu kartieren. Wir haben das zum Anlass genommen, das Genom von B. japonicum USDA 110 gründlich zu re-annotieren. Wir haben tausende von Transkriptionsstarts (TSSs) kartiert und die Daten benutzt, um Promoters stromaufwärts von den TSSs de novo vorherzusagen und zu kartieren. Dies wurde erreich in Kooperation mit Bioinformatikern (M. Gelfand, Russland und M. Imakaev, USA), die spezielle Tools eigens dafür entwickelt haben. Mittels Proteogenomics wurde der Proteinsatz von B. japonicum um 107 neue Proteine auf 4090 Proteine erhöht (in Kooperation mit C. Ahrens, Schweiz) Die Daten sind als gff und gbk Annotationsfiles allgemein zugänglich und hiermit eine wichtige Ressource für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Insgesamt wurden TSSs von tausenden potentiellen kleinen regulatorischen RNAs (sRNAs) und antisense RNAs (asRNAs) kartiert. Im Laufe des Projekts wurden insgesamt 17 neue RNA-Familien validiert und charakterisiert, wobei einige der sRNA-Gene spezifisch unter Symbiose exprimiert werden. Eine der sRNAs (BjsR4) hat sich als potentieller Regulator der Stressantwort unter hoher Eisenkonzentration in freilebenden Bakterien erwiesen. Eingehend wurde auch eine asRNA untersucht, die sich als nicht-funktionelles Nebenprodukt einer Transkriptionsinterferenz erwiesen hat. Darüber hinaus hat die Untersuchung von sRNAs in 3‘-Regionen von mRNAs zur Entdeckung von zwei neuen repetitiven palindromischen Sequenzen (REPs) geführt, die für ökologischen Fingerprint-Studien von Bradyrhizobien nützlich sein werden. Überraschenderweise hat sich eine sehr konservierte kleine RNA als mRNA herausgestellt. Die Translation des entsprechenden kleinen Proteins RreB wird offenbar durch eine extrem starke Interaktion mit dem Ribosom reguliert. Das Protein ist möglicherweise für das Überleben unter widrigen Umweltbedingungen wichtig. RreB illustriert das Vorhandensein von sehr kleinen, nicht annotierten Genen in B. japonicum. Sogar unter den im Rahmen des Projektes zusätzlich annotierten 1391 Genen sind 78% kleiner als 80 Codons. Unsere Untersuchung ihrer phylogenetischen Distribution ist wichtig für zukünftige Analysen von kleinen Proteinen in Alphaproteobakterien.
Publications
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