Charakterisierung von Biosynthese, Trafficking und Metabolismus des extrazellulären Calcium-Sensing Rezeptors (CaR) im heterologen und autologen Zellsystem
Final Report Abstract
Die Steuerung der Parathormonsekretion, einem Hormon mit potenter osteoanaboler Wirkung, durch den Calcium-Sensing Rezeptor (CaR) macht die Suche nach pharmakologischen Liganden dieses G-Protein-gekoppelten Rezeptors zum Gegenstand moderner Arzneimittelforschung. Negative allosterische Modulatoren des CaR wurden im Tierversuch zur Therapie der Osteoporose eingesetzt; positive allosterische Modulatoren stehen kurz vor der Zulassung beim renalen Hyperparathyreoidismus. Im Rahmen des genarmten DFG-Projektes wurden intrazellulaere Prozessierung und Trafficking des CaR untersucht. Wir finden, dass die Stimulation mit 10 mM Ca2+e in einer signifikanten Extemal isierung des CaR resultiert. Dabei handelt es sich um neusynthetisierte und nicht um recycelte Rezeptoren, was darauf hinweist, dass eine Inkubation mit dem Agonisten Calcium zu einem beschleunigen Transport des Rezeptors zur Zeiloberoberflaeche fuehrt. CaR interagiert mit den Chaperonen des endoplasmatischen Retikulums Calnexin und Calretikulin. In Gegenwart des Agonisten (10 mM Ca e) ist die Interaktion von CaR und Calnexin signifikant reduziert, eine direkte Folge der erhoehten intrazellulaeren Calciumkonzentration nach Rezeptoraktivierung. Dies koennte den Export des Rezeptors aus dem endoplasmatischen Retikulum foerdem und steht im Einklang mit der Extemal isierung des Rezeptors nach einstuendiger Inkubation mit dem Agonisten Calcium. Darueber hinaus haben wir die Regulation intrazellulaerer Signalkaskaden (Aktivierung von Phospholipase C, Phosphorylierung von MAPK) durch second-messenger Kinasen (Proteinkinase C), GPCR-kinasen (GRK 2-6) und ß-Arrestine untersucht. Im heterologen Zellsystem GripTite 293 MSR™ transfiziert mit CaR und GRK2-6 oder ß-Arrestinen konnten wir zeigen, dass die Stimulation von Phospholipase C (PLC) durch GRK2 und 3 signifikant gehemmt wird. Genannte Inhibition wird ueberwiegend durch eine direkte Interaktion von GRK2 und Gq/n-Proteinen vermittelt. ß-Arrestine hatten einen moderaten inhibitorischen Effekt auf die PLC-Stimulation (2). Die Hemmung der CaR-abhaengigen PLC-Stimulation durch ß-Arrestine war aufgehoben fuer einen mutanten Rezeptor, in welchem alle potentiellen Phosphorylierungsstellen von Proteinkinase C durch Alanine substituiert waren (2). Andererseits ist die enzymatiche Aktivitaet von GRK2 eine Voraussetzung fuer die langanhaltende Phosphorylierung von ERKl/2 nach Aktivierung von CaR
Publications
- Functional desensitization of the extracellular calcium-sensing receptor is regulated via distinct mechanisms: role of G protein-coupled receptor kinases, protein kinase C and beta- Arrestins (2007) Endocrinology 148 (5): 2398-2404.
Lorenz S, Frenzel R, Paschke R, Breitwieser GE, Miedhch SU.
