Effect of snare complex zipping during large dense-core vesicle priming and fusion

• Applicant: Professor Dr. Jakob Balslev Soerensen
• Subject Area: Molecular Biology and Physiology of Neurons and Glial Cells
• Term: from 2005 to 2007
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 5449193

Während der Exozytose formt sich zwischen Vesikel und Plasmamembran der sogenannte SNARE-Komplex, ein Bündel aus vier a-Helices, gebildet von dem Vesikelprotein Synaptobrevin und den beiden Plasmamembran-proteinen SNAP-25 und Syntaxin. Dieses Bündel hält damit Vesikel und Plamamembran zusammen. Laut der 'Zipper'- (de: Reissverschluss-) Hypothese bildet sich der Komplex von den N-terminalen Enden in Richtung der C-terminalen Membranverankerungen von Syntaxin und Synaptobrevin fort, was schließlich zur Membranverschmelzung führt. Ich beabsichtige diese Hypothese zu untersuchen, indem ich die 16 hydrophoben Interaktionsschichten, die den Komplex zusammenhalten, gezielt verändere. Dies wird dadurch erreicht, dass durch Mutationen in SNAP-25 in jeder Schicht zwei größere hydrophobe Aminosäuren durch Alanin ersetzt werden. Die mutierten Proteine werden in SNAP-25-null Mäuse-Chromaffinzellen überexpremiert und Exozytose wird mit elektrophysiologischen Methoden untersucht (Kapazitanz- und Kalziummessungen; Amperometrie; photolytische Kalziumfreisetzung). Kinetische Analysen müssen dann durchgeführt werden um Effekte auf die Auslösung der Verschmelzung ('Triggering') von Effekten auf frühere Vesikel-Rekrutierungsschritte zu unterscheiden. Dadurch soll festgestellt werden, ob der SNARE-Komplex (der Reissverschluß) sich schon vor oder erst nach dem Kalziumsignal für Exozytose bildet, ob ein teilweise geformter Komplex mit dem verschmelzungsreifen ('primed') Zustand einhergeht, und ob die Bildungsrichtung N- bis C-terminal ist, wie die Hypothese postuliert. Die elektrophysiologischen Studien sollen durch biochemische und theoretische molekulardynamische Untersuchen der mutierten Proteine ergänzt werden.

• DFG Programme: Research Grants