Knock-down von VCAM-1 durch rekombinante Antikörper
Final Report Abstract
Im vorliegenden Projekt ist es gelungen, einen funktionalen Knockdown des Oberflächenproteins VCAM-1 mittels intrazellulärer Antikörper (intrabodies) herbeizuführen. Dazu wurde ein eukaryotischer Expressionsvektor entwickelt, der neben dem spezifischen scFv auch eine ER-Retentionssequenz trägt, über die der produzierte Antikörper im ER der Zelle zurückgehalten wird. Durch die spezifische Bindung des Antikörpers an sein Antigen, VCAM-1, wird auch dieses im ER zurückgehalten und verschwindet somit im Laufe der Zeit von der Zelloberfläche. Die Knockdown-Experimente wurden in einer transfizierten VCAM-1-positiven Zelllinie durchgeführt, da eine endogene VCAM-1-positive Zelllinie eine zu geringe Transfektionseffizienz aufwies. Durch Koexpression des Knockdown-Konstruktes in der VCAM-1-positiven Zelllinie konnte ein zeitabhängiger Knockdown von VCAM-1 gezeigt werden. Die Funktionalität der Knockdowns wurde in einem speziellen Adhäsionsassay nachgewiesen, bei dem die Oberflächenpräsenz von VCAM-1 von essentieller Bedeutung ist. Mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie konnte außerdem verdeutlicht werden, dass bei einem Knockdown mittels intrabodies eine Kolokalisation von Antikörper und Antigen in der Zelle vorliegt. Zusammenfassend scheint der posttranslationale Knockdown von Proteinen durch Koexpression von intrabodies eine vielversprechende Methode zu sein, um z. B. Protein-Funktionen in vitro und in vivo zu untersuchen.
Publications
- Functional knockdown of VCAM-1 at the posttranslational level with ER retained antibodies. J Immunol Methods (2009), 341(1-2):30-40
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(See online at https://doi.org/10.1016/j.jim.2008.10.012) - (2010) Cloning of variable domains from mouse hybridoma by PCR. In: Antibody Engineering (2nd ed) Springer Protocols. ISBN 978-3-642-01143-6
Strebe, N., Breitling, F., Moosmayer, D., Brocks, D. & Dübel, S.
(See online at https://doi.org/10.1007/978-3-642-01144-3_1)
