Identifizierung von neuronalen Proteinrezeptoren clostridieller Neurotoxine und Charakterisierung der Wechselwirkung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die sieben Serotypen der Botulinusneurotoxine (BoNT/A bis G) blockieren die Neurotransmitterfreisetzung. Voraussetzung für ihre selektive Wirkung ist die spezifische Bindung an Nervenzellen. Sie wird von Gangliosiden vermittelt. Darüber hinaus wird postuliert, dass für ihre Aufnahme eine zusätzliche Bindung an einen Proteinrezeptor erforderlich ist. Mittels Toxizitätsmessungen an Nervus phrenicus-Präparaten von Wild-Typ und Gangliosiddefizienten Mäusen konnten wir zeigen, dass dem Zelleintritt aller sieben Serotpyen der BoNT eine Wechselwirkung mit komplexen Gangliosiden vorausgeht. Dies war bislang für BoNT/C und BoNT/D nicht Konsens. Zu Beginn dieses Projektes waren nur die Proteinrezeptoren für BoNT/B und BoNT/G identifiziert. Beide nutzen den intravesikulären Abschnitt des synaptischen Vesikelproteins Synaptotagmin (Syt), das im Zuge der Neurotransmitterfreisetzung temporär auf der Nervenzelloberfläche exponiert wird. Unsere Hypothese für die angestrebte Identifizierung der Proteinrezeptoren der anderen BoNT war, dass alle mittels Bindung an Proteine synaptischer Vesikel und deren Recycling in Nervenzellen gelangen. Diese Annahme konnten wir dadurch erhärten, dass alle BoNT durch Stimulation der Exo- und Endozytose schneller in periphere Neurone aufgenommen werden und nachweisen, dass der Proteinrezeptor für BoNT/A das synaptische Vesikelglykoprotein 2 (SV2) ist. Interaktionsexperimente mit den Zellbindungsfragmenten der BoNT zeigten zudem, dass bis auf BoNT/C alle BoNT an Syt oder SV2 binden können. Die Aufklärung der Struktur eines Kokristalls der Zellbindungsdomäne von BoNT/C mit Sialinsäure (eines terminalen Zuckers von komplexen Gangliosiden) und Mutationsund Gangliosidbindungsexperimente ließen uns schlussfolgern, dass BoNT/C überraschenderweise vermutlich alleine über die Interaktion mit zwei Gangliosidmolekülen in Nervenzellen gelangt. Für die Entwicklung von Inhibitoren gegen Botulinustoxine bzw. für die Wirkungsverbesserung der Toxine, wenn sie als Pharmaka zur Behandlung von auf Hyperaktivität von cholinergen Nerven beruhenden Erkrankungen eingesetzt werden, ist es erforderlich, den Rezeptorbindungsmodus genau zu kennen. Die atomaren Details der BoNT/B-Rezeptor- Interaktion haben wir durch Kokristallisation der Zellbindungsdomäne von BoNT/B mit dem intravesikulären Abschnitt des Proteinrezeptors Syt ermittelt und durch Mutationsanalysen bestätigt, dass das unstrukturierte Syt bei Kontakt mit BoNT/B eine helikale Konformation einnimmt und an eine sattelförmige Region an der C-terminalen Spitze von BoNT/B bindet (http://www.innovations-report.de/html/berichte/medizin_gesundheit/bericht-76252.html; Laborjournal 09/2007, S. 40-41). Die Position der Proteinrezpetorbindungsregion und der Bindungsmodus sind in BoNT/G im Wesentlichen konserviert. Unsere Hypothese, dass die Bindungsstellen für den Proteinrezeptor generell an der C-terminalen Spitze der Toxine liegen, muss aber dahingehend korrigiert werden, dass zumindest eine weitere Bindungstasche in BoNT/A und E zur Interaktion mit SV2 beizutragen scheint.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2006). Botulinum neurotoxin B recognizes its protein receptor with high affinity and specificity. Nature 444, 1092-1095
Jin, R., Rummel, A., Binz, T., and Brunger, A. T.
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(2006). The synaptic vesicle protein 2C mediates the uptake of botulinum neurotoxin A into phrenic nerves. FEBS Lett. 580, 2011-2014
Mahrhold, S., Rummel, A., Bigalke, H., Davletov, B., and Binz, T.
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(2007). Identification of the protein receptor binding site of botulinum neurotoxins B and G proves the double receptor concept. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 359-364
Rummel, A., Eichner, T., Weil, T., Karnath, T., Gutcaits, A., Mahrhold, S., Sandhoff, K., Proia, R., Acharya, K. R., Bigalke, H., and Binz, T.
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WO2007/048638 A2: Der Botulinus Neurotoxin A Proteinrezeptor und seine Anwendungen
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(2009). Botulinum neurotoxins C, E and F bind gangliosides via a conserved binding site prior to stimulation-dependent uptake with botulinum neurotoxin F utilising the three isoforms of SV2 as second receptor. J. Neurochem. 110, 1942- 1954
Rummel, A., Häfner, K., Mahrhold, S., Darashchonak, N., Holt, M., Jahn, R., Beermann, S., Karnath, T., Bigalke, H., and Binz, T.
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(2009). Cell entry strategy of clostridial neurotoxins. J. Neurochem. 109, 1584-1595
Binz, T. and Rummel, A.
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(2010). Botulinum neurotoxin serotype D attacks neurons via two carbohydrate binding sites in a ganglioside dependent manner. Biochem J. 431, 207-216
Strotmeier, J., Lee, K., Völker, A. K., Mahrhold, S., Zong, Y., Zeiser, J., Zhou, J., Pich, A., Bigalke, H., Binz, T., Rummel, A., Jin, R.
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(2011). Exchange of the HCC domain mediating the double receptor recognition improves the pharmacodynamic properties of botulinum neurotoxin. FEBS J. 278, 4506-4515
Rummel, A., Mahrhold, S., Bigalke, H., and Binz, T.
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(2011). The biological activity of botulinum neurotoxin type C is dependent upon novel types of ganglioside binding sites. Mol. Microbiol. 81, 143-156
Strotmeier, J., Gu, S., Jutzi, S., Mahrhold, S., Zhou, J., Pich, A., Eichner, T., Bigalke, H., Rummel, A., Jin, R., and Binz, T.
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(2012). Human synaptotagmin-II is not a high affinity receptor for botulinum neurotoxin B and G: increased therapeutic dosage and immunogenicity. FEBS Lett. 586, 310-313
Strotmeier, J., Willjes, G., Binz, T., and Rummel, A.
