Funktion Eisen-transportierender CDF-Proteine in magnetotaktischen Bakterien und E. coli
Final Report Abstract
Magnetotaktische Bakterien (MTB) synthetisieren intrazellulär Ketten von Kristallen des magnetischen Minerals Magnetit (Fe 3 O 4 ), deren Biomineralisation mit der Aufnahme und dem Transport großer Mengen von Eisen in die Magnetosomenvesikel verbunden ist. Mechanismus und Regulation des Eisentransports waren bisher unbekannt. Das Ziel dieses Projekts bestand daher in der Charakterisierung der mutmaßlichen magnetosomalen Eisentransportproteine MamB und MamM aus dem magnetischen Bakterium M. gryphiswaldense. Sequenzanalysen identifzierten MamBM als prototypische und in allen bekannten MTB stark konservierte Vertreter einer als MTB-CDF bezeichneten neuen Entwicklungslinie innerhalb der Cation Diffusion Facilitator-Familie von Metalltransportern. Deletionsmutanten je eines der beiden Gene waren defekt in der Magnetosomensynthese und akkumulierten intrazellulär 20- 40fach weniger Eisen als der Wildtyp. Experimente zur gerichteten Mutagenese von verschiedenen MTB-spezifischen Sequenzmotiven ergaben, dass diese in MamB, aber nicht in MamM essentiell für die Funktionalität sind. Die Abwesenheit von MamM führt auch zur niedrigeren intrazellulären MamB-Levels. Dies lässt sich durch eine stabilisierende Funktion der Interaktion beider Proteine erklären, die durch reziproke pull-down Experimente nachgewiesen werden konnte. Westernblots und Fluoreszenzmikroskopie von GFP-markierten MamB und MamM-Proteinen zeigten, dass beide Proteine am stärksten in der Magnetosomenmembran exprimiert werden, in signifikanten Mengen jedoch auch in der Cytoplasmammebran nachweisbar sind. Die stärkste Expression von MamBM war unter magnetitbildenden (d. h. mikroaeroben eisensuffizienten) Bedingungen nachweisbar, unterliegt aber nicht der globalen Regulation durch das Ferric uptake regulator (Fur)-Protein. Beide Proteine konnten rekombinant in E. coli überproduziert und gereinigt werden, was die Möglichkeit für künftige biochemische Analysen und in vitro Rekonstitutionsexperimente eröffnet.
Publications
- 2007. Intracellular Magnetite Biomineralization in Bacteria Proceeds via a Distinct Pathway Involving Membrane-bound Ferritin and Ferrous Iron Species. Angew. Chemie Int. Edition 46:8647-8652
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