Verstärkte CD4+ T-Zellaktivierung durch HSP70-gebundene Peptide: Mechanismen und klinische Relevanz bei Autoimmunerkrankungen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Hitzeschockproteine (HSPs) sind ubiquitär vorkommende Proteine mit multiplen Funktionen. Die Fähigkeit von HSPs antigene Peptide zu binden und die MHC Klasse II-vermittelte Aktivierung von humanen CD4+ T-Zellen zu beeinflussen, wurde in dem hier verfolgten Ansatz vor allem vor dem Hintergrund der Autoimmunerkrankung Diabetes mellitus Typ 1 (DM1) untersucht. In unserer Arbeitsgruppe konnte bisher eine spezifische Interaktion zwischen HSPs und MHC Klasse II Molekülen gezeigt werden, was auf eine Funktion von HSPs als Überträger antigener Peptide hindeutet. Im Rahmen des geförderten Projektes konnte nachgewiesen werden, dass die Stimulation humaner CD4+ T-Zellen mit HSP-gebundenen Allo-Antigenen, wie z. B. dem Influenzapeptid HA307- + 319 und dem Tetanus Peptid TT947-966 eine verstärkte antigenspezifische CD4 T-Zellantwort vor allem bei sehr niedrigen Antigenkonzentrationen zur Folge hat. Um mögliche Rezeptoren von HSP:Peptid-Komplexen für die MHC Klasse II-vermittelte Aktivierung auf antigenpräsentierenden Zellen (APZs) zu ermitteln, wurde die Proteinexpression potentieller Rezeptoren, wie CD91 und CD36, durch RNA Interferenz in humanen Monozyten herunterreguliert (Knockdown). Weitere mögliche Rezeptoren wie die Scavenger Rezeptoren, konnten durch Zugabe von bekannten Inhibitoren (Fucoidan, Polyinosin) blockiert werden. Unsere Versuche ergaben, dass bei Knockdown von CD91 auf den APZs die verstärkte Proliferation durch Hsp70:Peptid-Komplexe signifikant verringert werden konnte, wohingegen die verminderte Expression von CD36 keinen signifikanten Einfluss hatte. Einen additiven Effekt zu dem Knockdown von CD91 hatte die Blockade weiterer Scavenger Rezeptoren durch Fucoidan oder Polyinosin, was auf mehrere Rezeptoren für Hsp70:Peptid-Komplexe auf APZs hinweist, wobei CD91 eine Hauptrolle zu spielen scheint. Hinsichtlich der Zytokinproduktion von T-Zellen durch HSP:Peptid-Komplexe konnte keine Veränderung des Zytokinmusters durch Hsp70 gesehen werden. Vielmehr werden durch die vermehrte Aktivierung von T-Zellen sowohl vermehrt Th1- als auch Th2-Zytokine gebildet ohne einen intrinsischen Effekt von Hsp70. Anhand von fluoreszenzmarkierten Peptiden konnte gezeigt werden, dass durch die Komplexierung von Peptiden an Hsp70 eine gesteigerte Aufnahme des Peptids in die APZs erfolgt, was ursächlich für die gesteigerte Proliferation reagierender T-Zellen bei niedrigen Antigen-Konzentrationen sein könnte. Autoimmunerkrankungen wie der Diabetes mellitus Typ 1 sind T-zellvermittelte Erkrankungen über deren Pathogenese wenig bekannt ist. Durch die Untersuchung von T-Zellen gesunder Spender sowie von Patienten sollte geklärt werden, ob HSP-gebundene, Diabetes-assoziierte Auto-Antigene wie GAD65555-567 und PPI77-90 oder auch das mit Keimzell- und Neuroblastom-assoziierte Peptid NY-ESO1122-133 die Aktivierung autoreaktiver CD4+ T-Zellen beeinflussen können. Es zeigte sich zunächst, dass von diesen Autoantigenen lediglich GAD65555-567 und NY-ESO1122-133 eine Bindung mit Hsp70 aufweisen können. Bei weiteren Versuchen konnte zwar bei gesunden Spendern autoantigenspezifische T-Zellen gegen GAD65555-567, NY-ESO1122-133 und PPI77-90 nachgewiesen werden, aber es konnte bei keinem dieser Peptide reproduzierbar eine verstärkte Proliferation von T-Zellen durch Komplexierung an Hsp70 dokumentiert werden. Dies könnte evtl. auf die zur Detektion von auto-antigenspezifischen T-Zellen hohe Peptid-Konzentrationen von 10 µg/ml zurückzuführen sein. Der Nachweis von auto-antigenspezifischen T-Zellen bei Patienten mit DM1 gelang leider nicht, so dass ein Einfluss von Hsp70 nicht untersucht werden konnte. Tendenziell werden in unseren Versuchen CD4+ T-Zellen, die durch Hsp70-Peptid-Komplexe aktiviert werden, weniger stark durch CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen (Tregs) in der Proliferation gehemmt. Eine Ursache könnte die verstärkte Aktivierung der Zellen darstellen, da verschiedene Studien zeigten, dass hoch aktivierte T-Zellen weniger empfänglich sind gegenüber Regulationsmechanismen durch z. B. Tregs oder auch TGF- 1. Insgesamt konnte durch die vorliegenden Ergebnisse der Rezeptor für Hsp70:Peptid-Komplexe bei der MHC II-vermittelte Antigenpräsentation definiert werden. Die Hauptrolle scheint dabei bei der Präsentation auf Monozyten CD91 und zu einem kleineren Teil auch anderen Scavenger Rezeptoren zuzukommen. Das Muster der Zytokinsekretion der reagierenden antigenspezifischen T-Zellen wird dabei durch eine Komplexierung des Antigens an Hsp70 nicht verändert. Um die Rolle von Hsp70 bei der Präsentation von Allo-Antigenen in der spezifischen Immunabwehr weiter zu untersuchen, sind Strukturanalysen von Hsp70 mit Deletionsmutanten und Visualisierung des intrazellulären Traffickings geplant. Dieses Projekt wird von der DFG seit November 2010 unterstützt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2007) 70 kDa heat shock proteins: specific interactions with HLA-DR molecules and their peptide fragments. Eur. J. Immunol. 37(4):1053-63
Haug, M.; Schepp, C.P.; Kalbacher, H.; Dannecker, G.E.; Holzer, U.
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(2007) Endocytosis of Hsp-chaperoned Proteins and Peptides is Essential for MHC II Dependent Peptide Presentation. 7th Annual Meeting of the Federation of Clinical Immunology Societies, San Diego, USA 2007, Clinical Immunology 123 (suppl1/07): 59
Straub, I.; Haug, M.; Wernet, D.; Dannecker, G.E.; Holzer, U.
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(2007) Impact of HSP-chaperoned peptides on the MHC class II-dependent presentation and activation of CD4+ T cells in regard of allo- and autoantigens. In Heat Shock Proteins: Potent Mediciators of Inflammation and Immunity, Asea, A. and Demaio, A. eds. Springer-Verlag
Haug, M.; Dannecker, G. E. and Holzer, U.
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(2008) Involvement of scavenger receptors as HSP-binding structures in MHC class II-restricted presentation of Hsp70-associated antigens. Joint Annual Meeting of Immunology of the Austrian and German Societies (ÖGAI, DGfI), Wien, Österreich 2008, Wien. Klin. Wochenschr., The Middle European Journal of Medicine 120 (suppl 1/08): 67
Fischer, N.; Haug, M.; Handgretinger, R.; Dannecker, G. E.; Rammensee H. G.; Holzer, U.
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(2008) Role of Scavenger Receptors as Endocytotic Receptors for human Hsp70 in MHC class II-dependent antigen presentation. 8th Annual Meeting of the Federation of Clinical Immunology Societies, Boston, USA 2008, Clinical Immunology 127 (suppl1/08):13
Fischer, N.; Haug, M.; Handgretinger, R.; Dannecker, G. E.; Holzer, U.
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(2010) Involvement of CD91 and scavenger receptors in Hsp70-facilitated activation of human antigen-specific CD4+ memory T cells. Eur. J. Immunol. 40(4):987-997
Fischer, N.; Haug, M.; Kwok, W. W.; Kalbacher, H.; Wernet, D.; Dannecker, G.E.; Holzer, U.
