Chemische und strukturelle Charakterisierung der HCV Hüllproteine E1 und E2
Final Report Abstract
Die Identifizierung von Disulfidbrücken in Proteinen und deren verlässliche Zuordnung zu diskreten Cystein-Resten stellt insbesondere für Proteine mit einer hohen Anzahl an Cysteinen eine große Herausforderung. Bislang gibt es kein routinemäßig durchführbares Protokoll. Für die beiden glykosylierten Hüllproteine E1 und E2 konnten wir ein Protokoll der Deglykosylierung und Proteolyse entwicklen, welches sehr reines und homogenes Protein bzw. Proteolysefragmente liefert. Die Identifizierung der Peptide mittels MALDI-MS erwies sich als sehr schwierig und eine vollständige Sequenzabdeckung konnte bislang nicht erzielt werden. Ausgehend von der cDNA eines humanen Antikörpers gegen El konnten wir ein scFv-Expressionskonstrukt herstellen und reinen scFv produzieren (anti-E1n-scFv). Die biophysikalische Charakterisierung dieses scFv wird derzeit durchgeführt. Für ein breites Screening potentieller Inhibitoren der E2-Wechselwirkung mit CD81 konnten wir einen Konstrukt von CD81-LEL herstellen, der die periplasmatische Expression der CD81-LEL Domäne ermöglicht. Mit Hilfe eines neu ausgearbeiteten Expressions- und Reinigungsprotokolls stehen somit ausreichende Mengen an reinem CD81-LEL für das Inhibitor-Screening zur Verfugung. Weiterhin kann dieses Protein in zellbiologischen Testsystemen verwendet werden.
Publications
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(2007). Structural and functional comparison of the nonstructural protein 4B in flaviviridae. J. Mol. Graph, Model. 26, 546-557
Welsch, C., Albrecht, M., Maydt, J., Herrmann, E., Welker, M.W., Sarrazin, C., Scheidig, A.J., Lengauer, T. & Zeuzem, S.
