Bedeutung der Konidienhüllproteine von Aspergillus fumigatus in frühen Pathogen-Wirt-Interaktionen
Final Report Abstract
Das Enzym Enolase wurde in verschiedenen Mikroorganismen als moonlighting Protein beschrieben. Diese in der Regel cytoplasmatischen Proteine können trotz Fehlens einer Signalsequenz auf die Zelloberfläche gelangen, wo sie z.B. Bindungen an Matrixproteine vermitteln können. Durch MALDI-TOF-Untersuchungen konnten wir die Enolase auf der Oberfläche von Konidien (Sporen) des humanpathogenen Schimmelpilzes Aspergillus fumigatus nachweisen. Nach Herstellung Enolase-spezifischer monoklonaler Antikörper konnten wir die Oberflächenlokalisation dieses Proteins mittels Immunfluoreszenz und FACS-Analyse bestätigen. Um die Bedeutung der Enolase bei der Bindung von Sporen an die extrazelluläre Matrix untersuchen zu können, wurde eine zusätzliche Kopie des Enolase-Gens unter der Kontrolle des konstitutiven gpdA-Promoters in A. fumigatus eingebracht. Der resultierende Stamm zeigte aber nur eine geringfügig stärkere Expression der Enolase im Gesamtextrakt (Immunblot) und auf der Konidienoberfläche (FACS, Immunfluoreszenz). Versuche die Expression des Enolase-Gens durch ein entsprechendes RNAi-Konstrukt herabzuregulieren wurden durchgeführt, allerdings konnte im Immunblot keine reduzierte Expression nachgewiesen werden. Ein Grund für dieses negative Ergebnis liegt vermutlich in dem von uns verwendeten AMA-1-Plasmid. Versuche mit einer GFP-kodierenden Variante dieses Plasmid ergaben, dass auch unter Selektionsdruck nur etwas 5-7% der Konidien das Plasmid enthielten. Mit Hilfe des GFP-Markers konnten wir zeigen, dass dieses Plasmid auch in Hyphen sehr schnell verloren geht. Ein Protokoll zur Reinigung rekombinanter, nativer Enolase konnte etabliert werden, so dass die Bedeutung dieses moonlighting Proteins für die Adhärenz der Konidien an Zellen und Matrixproteine nun untersucht werden kann. In einer Arbeit einer anderen Gruppe wurde kürzlich ein CipC-ähnliches Protein in größeren Mengen in Oberflächenextrakten ruhender A. fumigatus Sporen nachgewiesen. Unsere Untersuchungen mit einem entsprechenden monoklonalen Antikörper ergaben allerdings, dass dieses CipC-homologe Protein nur in Hyphen und weder in Gesamtextrakten von Konidien (Immunblot) noch auf der Konidienoberfläche (Immunfluoreszenz) nachweisbar ist.
