Charakterisierung des Molekularen Defektes bei an GM1-Gangliosidose erkrankten Alaskan Huskies unter Berücksichtigung aberranter Spleißprozesse
Final Report Abstract
Die vorliegende Studie analysierte and charakterisierte die molekulare Ursache und die Pathogenese der GMi-Gangliosidose beim Alaskan Husky. Der Defekt der GMi-Gangliosidose liegt in einer 19 Basenpaar (bp) Duplikation der kanine sauren ß-Galaktosidase. Diese ermöglicht die Entstehung zusätzlicher Bindungsstellen für Proteine mit wichtiger Funktion in der Intron/Exon-Erkennung (ESE - exonic splicing enhancer). Durch die alternative Bindung von Molekülen an den zusätzlichen oder konstitutiven Erkennungsstellen wird der Einbau des Exon 15 in die mRNA gesteuert. Als Folge entstehen zwei mRNA-Populationen aus dem abnormalen Allel, eine ohne das Exon 15 (exon skipping) und eine zweite mit dem Exon 15 und der Duplikation. Weitergehende Analysen zeigten, dass die zusätzlichen ESE vermutlich Wechselwirkungen mit intronischen Nukleotidsequenzen eingehen und so den Ausschluss des abnormalen Exon 15 bewirken. Die korrekte Prozessierung der Fusionsproteine erfolgte nur für Polypeptide, abgeleitet von Wildtyp-GLBl-Konstrukten Die Polypeptide, abgeleitet von abnormalen GLB l -Konstrukten wurden in die Lysosomen transportiert, allerdings verlief hier die Prozessierung der Vorläuferproteine abnormal. Messungen der ß-Galaktosidase zeigten, dass Polypeptide, abgeleitet von den Konstrukten mit der abnormalen ß-Galaktosidase, mit der 19 bp Duplikation oder ohne Exon 15, keine enzymatische Aktivität auswiesen. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen einen kausalen Zusammenhang zwischen der identifizierten genetischen Modifikation und der abnormalen posttranslationalen Prozessierung der mutanten G£ß7-Vorläuferproteine auf. Um die grundsätzliche Machbarkeit der Gentherapie für die GMi-Gangliosidose zu überprüfen, wurden spezifische Zinkfmger-Nukleasen (ZFN) für die Reparatur des genomischen Defektes entworfen. Die Überprüfung der Bindungs- und Schnitteigenschaften der hergestellten ZFN erfolgte an Minigenen bestehend aus Teilsequenzen der ß-Galaktosidase. Weitergehende molekulare Studien zeigten, dass die ZFN spezifisch den gewünschten DNA-Abschnitt erkennen und schneiden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die 19 bp Duplikation im Exon 15 der kaninen GLB1 die molekulargenetische Ursache der GMi-Gangliosidose beim Alaskan Husky darstellt und durch eine Leserasterverschiebung als auch durch die Beeinflussung der posttranskriptionellen GBL1 prä-mRNA Prozessierung zur Translation abnormaler GLB1- Moleküle beiträgt. Diese abnormalen Proteine erreichen zwar die Lysosomen, werden aber abnormal prozessiert und besitzen keine enzymatische Aktivität. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass ein therapeutischer Ansatz mittels ZFN grundsätzlich möglich ist, da diese künstlichen Fusionsproteine gezielt definierte GLB1 -Bereiche erkennen und schneiden können.
Publications
- Kreutzer, R., Kreutzer, M., Leeb, T. and W. Baumgärtner. Rapid and accurate GMrgangliosidosis diagnosis using a parentage testing microsatellite. Molecular and Cellular Probes, 2008 (Siehe online unter: doi:10.1016/j.mcp.2008.05.001)
- Kreutzer, R., Kreutzer, M., Pröpsting, M.J., Sewell, A. C., Nairn H.Y., Leeb, T., and W. Baumgärtner. Insights into post-translational processing of beta-galactosidase in an animal model resembling late infantile human G(Ml)-gangliosidosis. Journal of Molecular and Cellular Medicine, 2008 (Siehe online unter: doi:10.1111/j.l582- 4934.2007.00204.x)
- Kreutzer, R., Leeb, T., Müller, G., Moritz, A. and W. Baumgärtner, A duplication in the canine ßgalactosidase gene GLB1 causes exon skipping and GMl-gangliosidosis in Alaskan Huskies. Genetics 170,1857-1861,2005.
- Kreutzer, R., Müller, G., Leeb, T., Brenig, B., Moritz, A., und W. Baumgärtner. Ein Gentest fur die GM,- Gangliosidose beim Alaskan Husky. Tierärztl Prax 35 (K) 193-199,2007.
