Molekulare Grundlagen der Anionenleitfähigkeit neuronaler Glutamattransporter
Final Report Abstract
Für die FTIR-spektroskopischen Untersuchungen am bakteriellen Glutamattransporter (ecGLTP aus E. coli) und dem zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanal (CNG-Kanal aus M. loti) konnten drei verschiedene experimentelle Ansätze ausgearbeitet werden. Mit Hilfe der ATR-Spektroskopie kann der entsprechende Ligand durch Perfusion über einen Proteinstapel gebunden und wieder entfernt werden. Der Ligand kann auch über einen sog. „cage“ inaktiviert werden und durch Photolyse schlagartig freigestzt werden. Mit beiden Verfahren konnten IR-Differenzbanden des jeweiligen Membranproteins nachgewiesen werden. Deren Zuordnung bedarf jedoch weiterer Experimente. Um das entsprechende Membranprotein während der Aktivität zu beobachten, wurde die oberflächenverstärkte IR-Spektroskopie entwickelt und angewendet, mit der IR-Differenzspektroskopie einer Proteinmonoschicht unter Anlegen eines Membranpotentials durchgeführt werden kann. Die spezifische und orientierte Anbindung der Proteine via His- oder Strep-Tag und die nachfolgende Rekonstitution in eine Lipiddoppelschicht direkt an der Oberfläche konnten erfolgreich durchgeführt werden. Damit ist die Grundlage geschaffen für weitergehende Untersuchungen mit Hilfe der IR-Differenzspektroskopie, mit der Strukturänderungen auf der Ebene einzelner chemischer Bindungen verfolgt werden können. Beim Ionenkanal konnten die durch CD-Spektroskopie gewonnenen Ergebnisse bestätigt werden. Durch gezielte Mutationen im Bereich der Bindungstasche sollte eine Aufklärung des cAMP- Bindeprozesses möglich sein. Durch Herstellung von N-terminal verkürzten Mutanten des Ionenkanals könnten Unterschiede zwischen der Strukturänderung der Bindedomäne und des Volllängen-Proteins herausgearbeitet werden.
