Entwicklung eines Verfahrens zur Vermehrung autologer, adhärenter Zellen ausgehend von niedrigen Zellzahlen
Final Report Abstract
Es wurde ein Kultursystem entwickelt, mit dem es möglich ist, kleinste Zellmengen von unter 100 Zellen um den Faktor 200.000 zu vermehren. Mit herkömmlichen Verfahren ist eine solche Expansion bisher schwierig und umständlich. Sie ist aber unumgänglich, wenn es gilt, aus Biopsiematerial genügend Zellen für ein autologes Transplantat herzustellen, oder neu gewonnene Zellklone (bspw. Antikörper bildende Hybridome oder therapeutische Primärzelllinien) in ausreichender Zahl bereitzustellen. Geringe Zellkonzentrationen haben den Nachteil, dass die zelleigen produzierten Wachstumsfaktoren sich zu stark im Medium verdünnen und sich die Zellen deshalb nicht teilen oder gar absterben. Hohe Zellkonzentrationen müssen mit ausreichend Substrat versorgt werden, wozu bei adhärenten Zellen auch die Aufwuchsfläche gehört. Bisher wurden deshalb in solchen Anwendungen zunehmend größere Multiwellplatten eingesetzt, wobei die Zellen in der Regel trypsiniert und manuell umgesetzt werden mussten. Beides schädigt Zellen und verringert merklich die Wachstumsrate. Diese Probleme löst das hier entwickelte Verfahren. Im ersten Schritt werden die Zellen in sehr wenig Medium und mit wenigen Zellträgern als „vorläufiger Batch“ kultiviert. Ist eine ausreichende Menge an Zellen entstanden, werden mehr Medium und weitere Zellträger zugegeben, so dass gleichzeitig alle Substrate ergänzt, aber die Wachstumsfaktoren nur wenig verdünnt werden. Dieses Vorgehen wiederholt sich jeweils zu geeigneten Zeitpunkten während der Kultivierung. Die Zugaben von Trägern und Medium bleiben die einzigen Eingriffe in die Kultur. Um beurteilen zu können, wann diese Eingriffe notwendig sind, wurde eine online Analytik entwickelt, die aus zwei optischen Sauerstoffsonden zur Bestimmung der Sauerstoffverbrauchsrate und einem weiteren laser-optischen Sensor zur Bestimmung der AlamarBlue-Umsatzrate bestehen. Diese Sensoren befinden sich im Medienkreislauf des Reaktors und dienen zusätzlich zur Bestimmung der Förderleistung der Mediumpumpe, womit eine ausreichende Versorgung der Zellen sichergestellt wurde. Die begleitende offline Analytik zum Glukose- und Glutaminverbrauch bzw. zur Laktatbildung sowie mikroskopische Zählungen erbrachten jeweils übereinstimmende Ergebnisse, da alle Werte letztendlich zur Ermittlung der Zellzahl herangezogen werden können. Für die Entwicklung wurde die Maus-Zelllinie MHEC5-T verwendet, die relativ robust und anspruchslos ist. Zum Beweis der Übertragbarkeit der damit erhaltenen Ergebnisse und der allgemeinen Einsetzbarkeit des Reaktors stehen zurzeit Experimente mit der selbst etablierten primäre Zelllinie PAEC an. Diese stammt aus dem Aorta-Endothel eines Hausschweines und dient schon in einem anderen Projekt zum Studium der Besiedelung von künstlichen Herzklappen. AlamarBlue wird von der FDA zur Beurteilung von Zellkulturen empfohlen. Insofern war es überraschend, dass AlamarBlue schleichend Zellen vergiftet. Zum Beweis wurde die Energieladung (Energy Charge, EC; Verhältnis von ATP, ADP und AMP in der Zelle) von verschieden exponierten Zellen ermittelt. Es konnte festgestellt werden, dass der EC bereits nach 14h vom ursprünglichen Wert von 0,95 abweicht, nach 30h unter 0,75 liegt und nach 48h auf 0,67 weiter sinkt, wenn empfohlene AlamarBlue-Konzentrationen eingesetzt werden. Um AlamarBlue dennoch als weitere Referenzmessung benutzen zu können, wurde die Substanz selbst eingehend untersucht. Überraschenderweise konnte ein Wellenlängenbereich gefunden werden, der zur optischen Konzentrationsbestimmung deutlich besser geeignet ist, aber bisher kaum beschrieben wurde. In diesem Bereich arbeitet die im Projekt entwickelte laser-optische Messzelle, wobei jetzt nur noch ein hundertstel der normalen AlamarBlue-Konzentration notwendig ist. Diese geringe Konzentration liegt aber weit unter dem ermittelten Schwellenwert für die Beeinflussung des ECs und ist somit ohne Nachteil. Das Reaktorkonzept sowie Teile der Analytik wurden im Rahmen von Informationsveranstaltungen (Tag der offenen Tür, Lange Nacht der Wissenschaften 2007) am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik vorgestellt. Die Erkenntnisse der Energy-Chargebestimmung und der Delta-pH-Messtechnik wurden in ein Praktikum für die Studenten des Chemie- und Bioingenieurwesens der Universität Erlangen-Nürnberg integriert.
