Charakterisierung von pathogenen Oraganellen retinaler Pigmentepithelzellen mittels hochauflösender Fluoreszenzlebensdauer- und Infrarotspektroskopie-Bildgebung (HiResi4RPE)

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Dr. Martin Hammer; Professor Dr. Rainer Heintzmann; Dr. Daniela Täuber
• Fachliche Zuordnung: Augenheilkunde
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 542825796

In HiResi4RPE werden zwei neu entwickelte hochauflösende Bildgebungsmethoden zur Untersuchung von Organellen des retinalen Pigmentepitheliums (RPE) angewendet. Sie tragen so zu einem verbesserten Verständnis der Pathogenese der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) sowie ihrer klinischen Diagnose und Behandlung bei. AMD ist eine Erkrankung der äußeren Netzhaut und des RPE. Die Fluoreszenz-Lifetime-Imaging-Ophthalmoskopie (FLIO) wird zur nicht-invasiven klinischen Bildgebung genutzt. Die gemessenen Fluoreszenzlebensdauern stammen von autofluoreszierenden Granula (Melanin, Lipofuscin und Melano-Lipofuscin) im RPE. Deren Verteilung sowie die jeweiligen Fluoreszenzlebensdauern unterscheiden sich im RPE von AMD- und Kontrollaugen. Bisher wurde die Variation der Fluoreszenzlebensdauer nicht auf subzellulärer Ebene untersucht. Wir schlagen eine Kombination aus Bildscanmikroskopie (ISM) und Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopiebildgebung (FLIM) vor, um die Verteilung der Fluoreszenzlebensdauern auf der Skala einzelner Granula in der RPE-Schicht zu evaluieren. Der Einsatz von hochauflösender photoinduzierter Kraftmikroskopie im mittleren Infrarotbereich (PiF-IR) ermöglicht zusätzlich die Erforschung chemischer Veränderungen. Unser Projektvorschlag besteht aus den folgenden vier Arbeitspaketen: WP1: ISM-FLIM wird auf histologische RPE-Schnitte menschlicher Spenderaugen mit und ohne AMD-Pathogenese angewendet. Dies ermöglicht die Charakterisierung von Änderungen in der Fluoreszenzlebensdauer auf der Ebene einzelner Granula. WP2: Einem etablierten Schweine-RPE Zellen Transwell-Kulturmodell werden native oder photooxidierte Photorezeptoraußensegmente gefüttert. Dies induziert AMD-ähnliche Zellschäden. Der Effekt dieser Exposition auf das Überleben, die Integrität und die Funktion der Zellen wird mit transepithelialen Widerstandsmessungen, ELISA, Immunhistochemie und Western Blot untersucht. WP3: Zellkulturen aus WP2 werden mittels hochauflösendem ISM-FLIM untersucht. Zusätzlich werden Lipofuscin-, Melanolipofuscin- und Melanin-Granula isoliert und über einen Saccharosegradienten getrennt. Einzelne Granula werden mit ISM-FLIM untersucht. WP4: Fraktionen von Granula, die in WP3 isoliert wurden sowie Granula in histologischen Schnitten, werden mittels PiF-IR- und FTIR-Bildgebung untersucht zur chemischen Charakterisierung der Granulaoberflächen bzw. -körper. Die erhaltenen IR-Spektren werden mit denen synthetischer oder aufgereinigter RPE-Fluorophore verglichen. Die Kombination von hochauflösenden ISM-FLIM- und PiF-IR-Bilddaten erlaubt es, den Einfluss einzelner Fluorophore in den Granula auf die makroskopisch beobachtete Änderung der Fluoreszenzlebensdauern bei AMD zu erfassen. Dies verbessert das Verständnis von molekularen Mechanismen der Pathogenese der AMD. Weiterhin tragen diese Untersuchungen dazu bei, FLIO-Befunde besser zu verstehen, und stärken so die Anwendung dieser Technik für die AMD-Diagnostik.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen