Biogenese sekretorischer Granula im exokrinen Pankreas: Aufbau und Funktion der submembranösen Granulamatrix
Final Report Abstract
Für die Entwicklung erfolgreicher Therapiemöglichkeiten bei Erkrankungen des Pankreas, z. B. der akuten Pankreatitis, ist ein Verständnis der zellulären Vorgänge in den Azinuszellen des Pankreas notwendig, die die pathophysiologischen Veränderungen des Organs einleiten. In eigenen Vorarbeiten konnten wir zeigen, dass peripheren, assoziierten Proteinen der Zymogengranula-Membran/Granulamatrix eine essentielle Bedeutung für die Granulabiogenese und krankheitsrelevante Veränderungen des Pankreas zukommt. Im Rahmen des Forschungsvorhabens wurde ein auf Proteom/cs-Methoden (2D Gelelektrophorese und Massenspektrometrie) basierender experimenteller Ansatz entwickelt, um Proteine der Granulamembran/-matrix zu isolieren, anzureichern und zu identifizieren. Durch das von der DFG bewilligte 2D Gelelektrophoresesystem konnte die Auftrennung der Proteinproben deutlich verbessern werden. Eine kombinierte Coomassie-Silber-Färbung wurde als Standardmethode etabliert, die die Detektion von Proteinspots erlaubt, die bisher unter der Nachweisgrenze lagen. Zudem wurde eine Technik zur Reinigung und Trypsinspaltung der Proteinspots im Labor etabliert und sie in Kombination mit MALDI-Anatysen zur Identifizierung von peripheren Membranproteinen einer basischen und sauren Gruppe eingesetzt. Wir konnten zeigen, dass viele Proteine der sauren Gruppe glykosyliert sind. Insgesamt wurden bisher 102 reproduzierbare Proteinspots mehrfach aus verschiedenen 2D-Gelen gestochen und massenspektrometrisch analysiert. Neben bereits bekannten peripheren Granulamembranproteinen konnten neben zahlreichen lipidspaltenden Enzymen mehrere periphere Mem bran proteine identifiziert werden, die bisher nicht als Granulaproteine beschrieben wurden (z. B. PPIB und Chymase (RMCP-1) (s. unten). Ausserdem konnte eine deutliche Interaktion der RNAse A mit der Granulamembran nachgewiesen werden. Interessanterweise können einige der identifizierten Proteine (RNAse A, PPIB, Chymase} mit Proteoglykanen interagieren, was unsere Hypothese von der Existenz einer submembranösen Proteoglykan-Matrix deutlich stützt. Zur Identifizierung integraler (u. fest assoziierter) Granulamembranproteine wurde die Methode der doubled SDS-PAGE etabliert. Hydrophobe Granulamembranproteine wurden durch zwei aufeinander folgende SDS-PAGE (dSDS-PAGE) unter Ausnutzung von Unterschieden in der Acrylamid- und Harnstoffkonzentration sowie der Leitionen aufgetrennt und massenspektrometrisch analysiert. Dabei ordnen sich die Proteine auf und um eine Diagonale an. Insgesamt wurden in den analysierten Gelen 126 Proteinspots analysiert und 92 davon identifiziert. Die identifizierten Proteine können aufgrund ihrer Funktion in 4 Gruppen eingeteilt werden: Protonenpumpen und lonenkanäle, Matrix- und Glyko-Proteine, Enzyme und Proteine mit unbekannter Funktion. Neben bekannten Granulamembranproteinen wurden auch Proteine identifiziert, die bisher nicht als Granulakomponenten beschrieben wurden (z. B. RabSA, PPIC, ADP/ATP Translocase 2(ANT2), VDAC1). Im weiteren wurden Studien zur Lokalisation und funktioneilen Analyse einiger identifizierter Granulaproteine durchgeführt bzw. begonnen. Zu ihnen gehören RabSA, Peptidyt-Prolyl cis/trans Isomerase B, Chymase (RMCP-1) sowie Syncollin (Bach et a)., 2006). Durch den Einsatz spezifischer Antikörper sowie morphologische (Immunfluoreszenz, Histologie, Elektronenmikroskopie) und biochemische Studien (Granula-Subfraktionierung, Immunoblotting) konnte die Lokalisation von RabSA, Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerase B und Chymase an Zymogengranula eindeutig nachgewiesen werden. Exogen in AR42J Zellen exprimierte Chymase wird in Zymogengranula sortiert und verpackt. Die mRNA Level dieser Proteine sind zudem nach Stimulation der Granulasekretion erhöht, was auf eine Abhängigkeit der Expression vom Fütterungsverhalten hinweist. In funktioneilen Studien mit RabSA spezifischer siRNA wurde ein Knock Down von RabSA herbeigeführt. Silencing von RabSA führte zu einer Inhibition der Granulabildung, zu einer Reduktion der regulierten Sekretion und zur Akkumulation von Granulaproteinen im Golgi-Komplex, während der Transport lysosomaler Proteine oder der von Plasmamembran-Proteinen nicht beeinflusst wurde. Diese Befunde weisen erstmalig auf eine Rolle von RabSA in der frühen Phase der Granulabiogenese hin und deuten an, dass RabSA ein für die Granulabildung essentielles Protein ist. Die Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerase B könnte die Konformation/Faltung bestimmter Verdauungsenzyme beeinflussen, so dass entweder die Verpackung erleichtert wird oder die Proenzyme in einer inaktiven Form gehalten werden, die eine vorzeitige Aktivierung verhindert. Eine Publikation mit den gewonnenen Resultaten zum RabSA wurde bereits eingereicht, zwei weitere Manuskripte mit den Daten zur PPIB und Chymase sind in Vorbereitung. Wie unsere Befunde zeigen, bilden diese Untersuchungen die Voraussetzungen für ein Verständnis der zellbiologischen Funktionen dieser Proteine bei der Granulabiogenese und bei krankheitsrelevanten Veränderungen des Pankreas. Mit der weiteren funktioneilen Charakterisierung dieser Moleküle erwarten wir u.a. neue Einblicke in die Prozesse der Granulabildung am trans-Golgi-Netzwerk (TGN), die Sortierung von Sekretproteinen und den Aufbau der Granulamembran/-matrix sowie Aufschluss über eine protektive und regulatorische Wirkung dieser Proteine.
Publications
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Bach J.-P, Borta H., Ackermann W., Faust, F., Borchers O., and Schrader M. (2006): The secretory granule protein syncollin localizes to HL-60 cells and neutrophils. J. Histochem. Cytochem. 54 (8): 877-88.
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Faust, F., H. Borta, M. Schrader: The small GTPase Rab8 is involved in zymogen granule formation in acinar cells of the exocrine pancreas. Eur. J. Cell Biol. 85S1 (Suppl. 56), S1-8 (abstr), 2006.
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Schrader M. (2004): Membrane targeting in secretion. In Membrane Dynamics and Domains, Subcellular Biochemistry, Vol. 37, pp. 391-421 (ed. P. J. Quinn), Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York.
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Stud. Med. Jan-Philipp Bach "Studies on the function of syncollin, a new membrane protein of pancreatic zymogen granules", finished 2006.
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Zeitungsbericht "In Matrix und Membran liegt Schlüssel zu Krankheit der Bauchspeicheldrüse", Oberhessische Presse, Marburg, 2004
