Molekulare Mechanismen der Translation: Termination der Polypeptidsynthese
Final Report Abstract
Die Überproduktion und Isolation des Terminationsfaktors RF2 aus Thermus thermophilus wurde erfolgreich durchgeführt und die Röntgenstruktur des kristallisierten Proteins bestimmt. Die Stabilität und physiologische Bedeutung der kompakten RF Strukturen wurden studiert. Es wird vermutet, dass diese kompakten Strukturen den Zustand der RF in Abwesenheit programmierter Ribosomen darstellen. Die Entfaltung in die längliche Struktur findet nach der Erkennung des Stopcodons am Ribosom statt. Isolation und Kristallisation des RF 1 aus Thermus thermophilus wurden erreicht, wegen der schlechten Kristallqualität konnte die Struktur dieses RF nicht bestimmt werden. Mit Antikörpern gegen das RF1 wurde im Translationssystem aus Escherichia coli das endogene RF1 inaktiviert. Im so modifiziertem Translationssystem konnte der Mechanismus der Suppression von AUG Stopcodons, Einbau von Aminosäuren aus beladener suppressor tRNASer(CAU) und der chemische Mechanismus der Peptidyl-tRNA Hydrolyse bei der Termination und des Peptidyl Transfers bei der Elongation untersucht werden. Die Ergebnisse führten zu einer Reihe neuer Erkenntnisse: 1) Die 2´OH Gruppe am terminalen Adenosin der Peptidyl-tRNA ist weder an der Übertragung des Peptidylrestes noch am Mechanismus der Hydrolyse des Peptidylrestes bei der Termination beteiligt. 2) Ein Verfahren zum ortspezifischen Einbau einer Azidfunktion in Polypeptide wurde ausgearbeitet und die orthogonale Modifikation des Polypeptids an dieser Azidfunktion demonstriert. 3) Wesentliche Erhöhung der Suppressioneffizienz bei der in vitro Translation in E. coli zellfreien Translation wurde durch Anwendung von Antikörpern gegen RF1 erreicht. 4) Struktur des RF1 aus Thermus thermophilus wurde bestimmt und seine Konformationsänderung als Teil des Mechanismus der Termination identifiziert.
Publications
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