Molekulare Mechanismen der Translation: Termination der Polypeptidsynthese
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Überproduktion und Isolation des Terminationsfaktors RF2 aus Thermus thermophilus wurde erfolgreich durchgeführt und die Röntgenstruktur des kristallisierten Proteins bestimmt. Die Stabilität und physiologische Bedeutung der kompakten RF Strukturen wurden studiert. Es wird vermutet, dass diese kompakten Strukturen den Zustand der RF in Abwesenheit programmierter Ribosomen darstellen. Die Entfaltung in die längliche Struktur findet nach der Erkennung des Stopcodons am Ribosom statt. Isolation und Kristallisation des RF 1 aus Thermus thermophilus wurden erreicht, wegen der schlechten Kristallqualität konnte die Struktur dieses RF nicht bestimmt werden. Mit Antikörpern gegen das RF1 wurde im Translationssystem aus Escherichia coli das endogene RF1 inaktiviert. Im so modifiziertem Translationssystem konnte der Mechanismus der Suppression von AUG Stopcodons, Einbau von Aminosäuren aus beladener suppressor tRNASer(CAU) und der chemische Mechanismus der Peptidyl-tRNA Hydrolyse bei der Termination und des Peptidyl Transfers bei der Elongation untersucht werden. Die Ergebnisse führten zu einer Reihe neuer Erkenntnisse: 1) Die 2´OH Gruppe am terminalen Adenosin der Peptidyl-tRNA ist weder an der Übertragung des Peptidylrestes noch am Mechanismus der Hydrolyse des Peptidylrestes bei der Termination beteiligt. 2) Ein Verfahren zum ortspezifischen Einbau einer Azidfunktion in Polypeptide wurde ausgearbeitet und die orthogonale Modifikation des Polypeptids an dieser Azidfunktion demonstriert. 3) Wesentliche Erhöhung der Suppressioneffizienz bei der in vitro Translation in E. coli zellfreien Translation wurde durch Anwendung von Antikörpern gegen RF1 erreicht. 4) Struktur des RF1 aus Thermus thermophilus wurde bestimmt und seine Konformationsänderung als Teil des Mechanismus der Termination identifiziert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Efficient suppression of the amber codon in E. coli in vitro translation system. FEBS Lett. (2005) 579, 2156-2160
Agafonov, D., Huang, Y., Grote, M. and Sprinzl, M.
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C-terminal modifications of a protein by UAG-encoded incorporation of puromycin during in vitro protein synthesis in the absence of release factor 1. ChemBioChem. (2006) 7, 330-6
Agafonov DE, Rabe KS, Grote M, Voertler CS, Sprinzl M
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C-terminal incorporation of bioorthogonal azide groups into a protein and preparation of protein-oligodeoxynucleotide conjugates by Cu'-catalyzed cycloaddition. ChemBioChem, (2007), 8, 1103-1106
Humenik,M.; Huang,Y.; Wang,Y.; Sprinzl,M.
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Release Factors 2 from Escherichia coli and Thermus thermophilus: structural, spectroscopic and microcalorimetric studies. Nucleic Acids Res., (2007), 35, 1343-53
Zoldak,G.; Redecke,L.; Svergun,D.I.; Konarev,P.V.; Voertler,C.S.; Dobbek,H.; Sedlak,E.; Sprinzl,M.
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Multidomain initiation factor 2 from Thermus thermophilus consists of the individual autonomous domains. Biochemistry. (2008) 47, 4992-5005
Zoldák G, Sedlák E, Wolfrum A, Musatov A, Fedunová D, Szkaradkiewicz K,Sprinzl M
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Peptide-bond synthesis on the ribosome: no free vicinal hydroxy group required on the terminal ribose residue of peptidyl-tRNA. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (2008) 47, 7242-45
Koch M, Huang Y, Sprinzl M
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Simultaneous and site-directed incorporation of ester linkage and azide group into polypeptide by in vitro translation. Organic and Biomolecular Chemistry (2009) 7,4218-24
Humenik M, Huang Y, Safronov I, Sprinzl M
