Pathogenese DNA-Reparatur-defizienter Kolonkarzinome: Funktion und pathophysiologische Bedeutung `echter Zielgene` der Mikrosatelliteninstabilität (MSI)
Final Report Abstract
Infolge eines defekten D N A-Reparatursystem s kommt es bei der Entstehung mikrosatelliteninstabiler (MSI) Tumore zur Anhäufung charakteristischer Mutationen in einer Vielzahl von Genen, von denen vermutlich nur ein kleiner Teil an der Progression der Tumore von benignen zu malignen Stadien beteiligt ist. Anhand eines von uns erarbeiteten statistischen Modells waren in Vorarbeiten 26 Gene identifiziert worden, deren Mutationsrate in kodierenden Mikrosatelliten (cMS) auf einen kausalen Zusammenhang mit der Tumorprogression schließen ließ {Selective Target Genes; SelTar-Gene). Zwanzig dieser Gene waren entweder in Ihrer Funktion völlig unbekannt oder Ihre Funktion war bisher nicht als krebsrelevant beschrieben worden. Ziel des Gesamtprojektes ist es, die Funktion einiger dieser 20 bisher unbekannten Gene in der Tumorentstehung und -progression aufzuklären. Im Rahmen der bewilligten Teilprojekte sollten zunächst anhand von Expressions- und weiterführenden Mutationsanalysen diejenigen Gene herausgefiltert werden, die mit hoher Wahrscheinlichkeit wachstumsinhibierende (Tumorsuppressor-) Eigenschaften in Kolonepithelzellen aufweisen. In Frage kamen insbesondere Gene, die sowohl in Kolon-Normalgewebe als auch in Tumorgewebe exprimiert werden sowie Gene, deren Produkte nur in Normalgewebe, nicht mehr jedoch in Tumorgewebe vorhanden sind. Weiteres Kriterium war außerdem ein häufiges Auftreten biallelischer Mutationen, die Defekte beider Genkopien und damit einen völligen Funktionsausfall des Genproduktes im Tumor zur Folge haben. Anhand von 10 Kolon-Normalgeweben und 12 Kolonkarzinomen mit unbekanntem MSI-Status, sowie 23 Kolonkarzinom-Zelllinien (17 MSI, 6 MSS) erfolgte daher zum einen eine detaillierte Analyse der mRNA-Expression aller 26 SelTar-Gene. Zum anderen wurde die allelspezifische Mutationsrate in cMS dieser Gene (mittels PCR, Fragmentlängenanalyse und GeneScan der cMS) anhand eines definierten Probenkollektivs von 20 mikrodissezierten MSI-Kolonkarzinomen und zugehörigem Normalgewebe sowie der 23 Kolonkarzinom-Zelllinien ermittelt. Vier der 20 SelTar-Gene (AIM2, PCNXL2 (FLJ11383), ASTE1 (HT001) und PTHLH (PTHL3)) wurden konstitutiv in Kolon- Normalgewebe exprimiert und wiesen außerdem häufig biallelische Mutationen in cMS auf. Durch Sequenzanalyse der gesamten kodierenden DNA des A/M2-Gens konnten weitere, im Tumor exprimierte Mutationen identifiziert werden. Das AIM2 (Absent in Melanoma 2) -Gen gehört zu einer Familie Interferon-induzierbarer Gene (HIN-200), deren Produkte im Zellkern Interferonvermittelte, wachstumsinhibierende Effekte ausüben. Seine genaue Funktion in der Kolon-Mukosa und in -Karzinomen ist bislang unbekannt. Unsere Untersuchungen belegen, dass AIM2 konstitutiv in Kolon-Normal- und Tumorgewebe exprimiert wird. In 19 der 23 Kolonkarzinom-Zelllinien war die AIM2- Expression durch IFN-y induzierbar, vier der Zelllinien waren hingegen resistent gegen die IFN-y - Induktion. Promotoranalysen mittels Bisulfit-Sequenzierung und die Re-Expression von AIM2 nach Behandlung der Zellen mit demethylierenden Agenzien deuten auf eine Hypermethylierung des AIM2- Promotors als Ursache dieser Resistenz hin. Zusammengefasst lassen unsere Daten auf einen Selektionsdruck in Richtung einer Inaktivierung des A//W2-Gens in MSI-Kolontumoren schließen.
