Posttranslationale Bildung von Ca-Formylglycin in eukaryonten Sulfatasen
Final Report Abstract
Im ER werden neu synthetisierte Sulfatasen durch das Formylglycin-generierende Enzym (FGE) modifiziert, wobei die Methylenthiol-Seitenkette eines konservierten Cysteins in eine Formaldehydgruppe eines Formylglycins umgewandelt wird. Das neu entstandene Formylglycin befindet sich nach der Faltung der Sulfatase im aktiven Zentrum und katalysiert dort die Spaltung der Sulfatesterbindung der Substrate. Mutationen im FGE-Gen (SUMF1) sind die Ursache für die Multiple Sulfatasedefizienz (MSD), bei der die katalytische Aktivität aller Sulfatasen vermindert ist. Nach der Identifizierung des FGE-Gens konnten wir in Rahmen des DFG-Projektes das Protein stabil in humanen Zellinien exprimieren und für die biochemische Charakterisierung und die Röntgenstrukturanalyse reinigen. Den Ergebnissen zufolge ist FGE eine Monooxygenase, die für die Oxidation der Cysteinseitenkette molekularen Sauerstoff verwendet. Im Gegensatz zu den meisten anderen Monooxygenasen venwendet FGE jedoch keine Kofaktoren wie Metallionen oder Pyrimidinnukleotide, ist aber von der Zufuhr Thiol-basierter Reduktionsäquivalente abhängig. Im Kristall zeigt FGE eine globuläre Struktur mit einer Substratbindungsstelle, die zwei katalytisch aktive Cysteine enthält. Auf der Basis der Redoxeigenschaften dieser Cysteine konnte ein Modell für den Mechanismus der Katalyse entwickelt werden. Für eine Reihe von Missense-Mutationen, die zu MSD führen, wurden auf Basis der Kristallstruktur Strukturänderungen vorausgesagt und deren Auswirkungen auf Stabilität und Aktivität des FGE-Moleküls im Zellkultursystem getestet. Die N-terminale Domäne des FGE (Aminosäuren 34-72), für die keine Kristallstrukturdaten vorliegen, erwies sich als essentiell für die in vivo-Aktivität und die Bindung an das ER-Protein ERp44, das die Retention des FGE im ER vermittelt. Die biochemische und die Röntgenstrukturanalyse des dem FGE homologen pFGE (paralog of FGE) zeigte eine große Strukturähnlichkeit mit FGE und wie für FGE die Eigenschaft Sulftasepeptide zu binden. Eine katalytische Aktivität zur Bildung von Formylglycin konnte für pFGE jedoch nicht nachgewiesen werden.
Publications
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