Structural and functional biology of the HP68 ABC ATPase
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Ziel dieser Arbeit war es, die zelluläre Funktion der hochkonservierten, essentiellen ABC-ATPase Rli1p (oder ABCE1) in Saccharomyces cerevisiae aufzuklären. Es konnte gezeigt werden, dass beide Nukleotid-Bindungsdomänen und eine Scharnierregion, welche die beiden ABC-Domänen miteinander verbindet, wichtig für die Funktion von Rli1p sind. Des Weiteren konnte auch das N-terminale Eisen-Schwefel Cluster Bindemotiv als essentielle Domäne identifiziert werden. Durch Überexpression von inaktiven Rli1p-Proteinvarianten wurde ein dominant-negativer Phänotyp erzeugt. Es konnte nachgewiesen werden, dass Rli1p im Zytoplasma mit Polyribosomen und (80S) Monosomen co-fraktioniert, aber die Mehrzahl an Rli1p mit der ribosomalen 40S Untereinheit assoziiert ist. Rli1p mit einem Subkomplex des Translationsinitiationsfaktors eIF3 und ribosomalen Proteinen interagiert. Diese Interaktion ist abhängig von RNA und funktionalen ABC-Domänen, sowie von eIF3j/Hcr1p, einer Untereinheit des Translationsinitiationsfaktors eIF3. Um die zelluläre Funktion von Rli1p näher charakterisieren zu können, wurde versucht eine konditional temperatursensitive Mutante herzustellen und Rli1p durch Repression der Transkription in vivo zu depletieren. Beide Ansätze waren nicht erfolgreich. Aus diesem Grund wurden in vitro Depletionssysteme etabliert. Immundepletion oder Inaktivierung eines mit TEV-Protease spaltbarem Rli1p führte zu einer Reduktion der Translationsaktivität und demonstrierte damit einen direkten Einfluss von Rli1p auf die Translation. Eine vollständige Inhibition der Translation einer Reporter-mRNA konnte durch Zugabe eines α-RLI1-Antikörper erreicht werden, wobei die Translationsextrakte einen Zerfall von den Polyribosomen und der 80S Komplexe in 60S und 40S Untereinheiten aufwiesen. Die Immunoinhibition konnte durch die Zugabe von gereinigtem Rli1p rückgängig gemacht werden. Neben einer biochemischen konnte auch eine genetische Interaktion von RLI1 mit HCR1 nachgewiesen werden. Durch Kombination eines Δhcr1 Knockout mit einem C-terminal markierten Rli1p entstand ein synthetisch-temperatursensitiver Phänotyp. Nähere Untersuchungen dieses Stammes zeigten eine Reduktion von Polyribosomen und einen Defekt bei der 60S Bindung an den Prä-Initiationskomplex, während die Ribosomenbiogenese nicht beeinflusst wurde. Für die zelluläre Funktion von Rli1p konnte ein Modell erarbeitet werden, in dem Rli1p den Translationsinitiationsfaktor eIF3 auf dem 40S Ribosom assembliert oder richtig positioniert. Diese Funktion des Rli1p könnte auch in der Anti-Assoziation von 80S durch eIF1, eIF1A und eIF3 von Bedeutung sein.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- X-ray structure of RLI, an essential twin cassette ABC ATPase involved in ribosome biogenesis and HIV capsid assembly. Structure 13, 649-659 (2005)
A. Karcher, K. Buttner, B. Maertens, R.- P.Jansen, and K.-P. Hopfner
